一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，包括以下步骤：(1)取治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品加水溶解、离心，取上清液加于层析柱上，洗脱液洗脱，收集暗红色带组分；(2)取暗红色带组分，然后加入人胰岛素的溶液和肌苷溶液混合液，然后上HPLC色谱检测，记录色谱图；(3)如果治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品的色谱峰位于人胰岛素和肌苷的色谱峰之间，呈近似正态分布，且其色谱峰的保留时间测定值Rt与计算值Rt，之间的相对偏差不得过±8％，则乙型肝炎美洲大蠊提取物成品是合格的，本发明专利技术通过制定了科学合理、可行性高的成分鉴别方法，能够应用于治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的生产和质量控制工程中，保证了该提取物的临床疗效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药
，具体来讲涉及一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法。
技术介绍
美洲大蠊为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称蟑螂，是蜚蠊科中体积最大的昆虫，原产于南美洲。美洲大蠊是传统的中药材入药始载于《神农本草经》,谓“味咸,寒。主血瘀、症坚、寒热，破积聚，喉咽搏，内寒，无子”，用以治疗小儿疳积、疔疮、痈肿、喉蛾、无名肿毒、梅毒以及毒蛇、蜈松咬伤等疾病。随着现代科学的不断发展，美洲大蠊的化学成分和药理作用的研究愈加深入。据文献报道，美洲大蠊中含有蛋白质、肽类、氨基酸、甲壳素、粘糖氨酸、核苷、脂肪酸、烯醇、烯酸、烷烃、多元醇、大环内酯类，酶类以及丰富的矿物质和微量元素。通过国内已有产品及相关药理活性研究情况看，美洲大蠊体内药效成分的生物活性主要包括：对各种外伤创面及机体溃疡具有良好的肌肉组织修复活性；具有强心升压，改善血液循环的活性；具有抗菌抗病毒的活性；具有抗肿瘤，增强免疫功能活性。我们前期从美洲大蠊提取分离得到治疗乙型肝炎有效成分，并申请了专利技术专利(201210446628.5)。但是该提取物成分十分复杂，目前尚没有一套完善的检测方法对其进行有效的检测。鉴于选取其中某一标志性成分作为检测对象并采用高效液相色谱法或薄层色谱法进行检测的难度较大，目前急需探索出一种新的简便有效的检测方法，以对该提取物进行质量控制。
技术实现思路
本专利技术提供了一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，为治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物提供了一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物提供了一种行之有效的质量控制方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，包括以下步骤：(1)取治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品加水溶解，离心弃去沉淀，取上清液加于层析柱上，洗脱液洗脱，收集样品前端的暗红色带组分；(2)取暗红色带组分，然后加入人胰岛素的溶液和肌苷溶液混合液，然后取混合液上HPLC色谱检测，记录色谱图；(3)人胰岛素和肌苷的色谱峰的保留时间测定值各为Rt1和Rt2，治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品的色谱峰的保留时间测定值为Rt，如果治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品的色谱峰位于人胰岛素和肌苷的色谱峰之间，呈近似正态分布，且其色谱峰的保留时间测定值Rt与计算值Rt’之间的相对偏差不得过±8％，则乙型肝炎美洲大蠊提取物成品是合格的，所述计算值的计算式：Rt’＝0.95×(Rt1+Rt2)/2所述相对偏差＝(Rt-Rt’)/Rt’×100％。优选地：所述的美洲大蠊提取物成品与水的比例为美洲大蠊提取物成品0.3g，加水5～10ml。优选地：所述的层析柱为SephadexG25或G10层析柱。优选地：所述的洗脱液中包括pH4～8的0.05～0.20mol/L氯化钾或氯化钠的0.005～0.030mol/L磷酸盐缓冲溶液。优选地：所述的人胰岛素的溶液和肌苷溶液混合液为人胰岛素的溶液与肌苷溶液按照体积比1:4～4:1混合所得的溶液，所述的人胰岛素的溶液为分子量5800Da的人胰岛素溶解于0.005～0.020mol/LKOH或NaOH溶液，形成浓度0.5～4.0mg/ml的溶液；所述的肌苷溶液为分子量268Da溶解于纯净水形成的浓度为0.5～4.0mg/ml的溶液。优选地：所述的色谱柱为Superdexpeptide10/300GL色谱柱。优选地：所述的HPLC色谱检测包括：进样量为40μL，以0.05～0.20mol/L氯化钾或氯化钠的0.005～0.030mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH4～8)为流动相洗脱，流速0.5～1.5mL/min，紫外225nm检测，记录色谱图。优选地：所述的治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物的制备方法，包括以下步骤：A、灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫采用80℃～90℃的热水杀死，控温在60℃±5℃范围内烘干，粉碎，过24目筛，制得美洲大蠊粗粉；B、提取：将步骤A所得美洲大蠊粗粉在75～80℃温度下进行3～5次回流提取，第一次提取时，加粗粉重量5～8倍量浓度90％～95％的乙醇，提取时间为4～6小时；第二次以后每次加粗粉重量3～6倍量浓度90％～95％的乙醇，提取时间为3～5小时；提取过程中，乙醇温度均保持在75～80℃；提取完成后，合并提取液，过滤得乙醇提取液；C、一级浓缩：将步骤B所得乙醇提取液在真空度-0.05～-0.06MPa、温度50～60℃的条件下减压浓缩，至比重为1.05～1.15时，得乙醇浓缩液；D、脱脂吸附：将步骤C所得乙醇浓缩液加入乙醇浓缩液重量7～10倍量的蒸馏水，边搅拌边升温至80～90℃后，搅拌10～60分钟，搅拌速度为20～60转/分，然后保温静置1～5小时使油水分层；收集下层水液，经滤纸过滤后，在所得滤液中加入乙醇浓缩液0.5～1.0倍量药用活性炭在40～60℃温度下搅拌30～60分钟，使其充分吸附；E、洗脱：将步骤D所得含活性炭药液装入层析柱中，放出药液，先用药用活性炭10～30倍量蒸馏水洗涤，水洗液弃去；再用药用活性炭30～60倍量的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，经滤纸过滤，得洗脱滤液；所用洗脱剂为浓度10％～20％、pH值2.0～3.0的醋酸乙醇液或浓度10％～20％醋酸的水饱和正丁醇溶液或苯酚浓度为10％～20％的苯酚乙醇液；F、二级浓缩：将步骤E所得洗脱滤液在温度50～60℃、真空度-0.05～-0.06MPa条件下减压浓缩，浓缩至比重为1.20～1.30时，得治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏；G、干燥粉碎：将步骤F所得治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏在50℃～60℃温度、真空度-0.04～-0.07MPa的条件下真空干燥，粉碎为细粉，即得到用于治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品。本专利技术的有益效果：由于治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的成分十分复杂，目前尚没有一套完善的检测方法对其有效成份进行相应的检测。鉴于选取其中某一标志性成分作为HPLC检测对象的可能性较低，本专利技术选择Sephadex层析柱与HPLC相结合的方法，对治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的相对分子质量进行检测，，形成一种针对性强、可操作性高的检测方法，填补了该有效成分检测领域的空白，能够应用于治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的生产控制方面。本专利技术的方法针对性强，可操作性高，是一种准确有效的检测方法。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例1的产品的HPLC图；图2为实施例2的产品的HPLC图；图3为实施例3的产品的HPLC图；图4为实施例4的产品的HPLC图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，包括以下步骤：取治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物0.3g，加水5.0m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品加水溶解，离心弃去沉淀，取上清液加于层析柱上，洗脱液洗脱，收集样品前端的暗红色带组分；(2)取暗红色带组分，然后加入人胰岛素的溶液和肌苷溶液混合液，然后取混合液上HPLC色谱检测，记录色谱图；(3)人胰岛素和肌苷的色谱峰的保留时间测定值各为Rt1和Rt2，治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品的色谱峰的保留时间测定值为Rt，如果治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品的色谱峰位于人胰岛素和肌苷的色谱峰之间，呈近似正态分布，且其色谱峰的保留时间测定值Rt与计算值Rt’之间的相对偏差不得过±8％，则乙型肝炎美洲大蠊提取物成品是合格的，所述计算值的计算式：Rt’＝0.95×(Rt1+Rt2)/2所述相对偏差＝(Rt‑Rt’)/Rt’×100％。

【技术特征摘要】
1.一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品加水溶解，离心弃去沉淀，取上清液加于层析柱上，洗脱液洗脱，收集样品前端的暗红色带组分；(2)取暗红色带组分，然后加入人胰岛素的溶液和肌苷溶液混合液，然后取混合液上HPLC色谱检测，记录色谱图；(3)人胰岛素和肌苷的色谱峰的保留时间测定值各为Rt1和Rt2，治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品的色谱峰的保留时间测定值为Rt，如果治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品的色谱峰位于人胰岛素和肌苷的色谱峰之间，呈近似正态分布，且其色谱峰的保留时间测定值Rt与计算值Rt’之间的相对偏差不得过±8％，则乙型肝炎美洲大蠊提取物成品是合格的，所述计算值的计算式：Rt’＝0.95×(Rt1+Rt2)/2所述相对偏差＝(Rt-Rt’)/Rt’×100％。2.根据权利要求1所述的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于：所述的美洲大蠊提取物成品与水的比例为美洲大蠊提取物成品0.3g，加水5～10ml。3.根据权利要求1所述的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于：所述的层析柱为SephadexG25或G10层析柱。4.根据权利要求1所述的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于：所述的洗脱液中包括pH4～8的0.05～0.20mol/L氯化钾或氯化钠的0.005～0.030mol/L磷酸盐缓冲溶液。5.根据权利要求1所述的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于：所述的人胰岛素的溶液和肌苷溶液混合液为人胰岛素的溶液与肌苷溶液按照体积比1:4～4:1混合所得的溶液，所述的人胰岛素的溶液为分子量5800Da的人胰岛素溶解于0.005～0.020mol/LKOH或NaOH溶液，形成浓度0.5～4.0mg/ml的溶液；所述的肌苷溶液为分子量268Da溶解于纯净水形成的浓度为0.5～4.0mg/ml的溶液。6.根据权利要求1所述的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于：所述的色谱柱为Superdexpeptide10/300GL色谱柱。7.根据权利要求5所述的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于：所述的HPLC色谱检测包括：进样量为40μL，以0.05～0.20mo...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝振平，徐溧，
申请(专利权)人：昆明赛诺制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53