【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医疗卫生
,具体涉及一种同位素稀释质谱法定量检测血清低丰度蛋白前处理流程。
技术介绍
同位素稀释质谱法特异性强、复现性好,因此是血清低丰度蛋白绝对定量的最佳方法,但是该方法的准确性显著依赖于蛋白的前处理优劣。现有的血清低丰度蛋白前处理流程较多,不同流程间差异较大,普遍存在重复性和复现性差的缺陷,严重影响了同位素稀释质谱法对血清低丰度蛋白的准确定量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的缺陷和不足,提供同位素稀释质谱法定量检测血清低丰度蛋白前处理流程。为了解决
技术介绍
所存在的问题,本专利技术的同位素稀释质谱法定量检测血清低丰度蛋白前处理流程,它的步骤如下:步骤一:高丰度蛋白去除:将100μL血清按试剂说明书步骤用Blue Albumin&IgG Depletion Kit去除绝大部分白蛋白和IgG,取180μL去除高丰度蛋白后的血清,并与70μL 25mM的碳酸氢铵溶液混合;步骤二:变性:将上述混合样本首先在100℃水浴下热变性5min,再冰浴5min冷却,然后加入约96.1mg尿素进行化学变性,漩涡30s后静置5min,最后加入250μL 25mM碳酸氢铵溶液稀释;步骤三:还原:加入50μL 100mM二硫苏糖醇,60℃水浴30min,使变性蛋白已打开的二硫键保持还原状态;步骤四:烷基化:加入50μL 550mM碘乙酰胺,黑暗中室温下作用30min,使半胱氨酸上的巯基烷基化,防止二硫键的形成;步骤五:终止烷基化:加入185μL 100mM二硫苏糖醇终止烷基化,且二硫苏糖醇与碘乙酰胺的摩尔比为1∶2,室温下作用30min ...
【技术保护点】
同位素稀释质谱法定量检测血清低丰度蛋白前处理流程,其特征在于:它的步骤如下:步骤一:高丰度蛋白去除:将100μL血清按试剂说明书步骤用Albumin & IgG Depletion Kit去除绝大部分白蛋白和IgG,取180μL去除高丰度蛋白后的血清,并与70μL 25mM的碳酸氢铵溶液混合;步骤二:变性:将上述混合样本首先在100℃水浴下热变性5min,再冰浴5min冷却,然后加入约96.1mg尿素进行化学变性,漩涡30s后静置5min,最后加入250μL 25mM碳酸氢铵溶液稀释;步骤三:还原:加入50μL 100mM二硫苏糖醇,60℃水浴30min,使变性蛋白已打开的二硫键保持还原状态;步骤四:烷基化:加入50μL 550mM碘乙酰胺,黑暗中室温下作用30min,使半胱氨酸上的巯基烷基化,防止二硫键的形成;步骤五:终止烷基化:加入185μL 100mM二硫苏糖醇终止烷基化,且二硫苏糖醇与碘乙酰胺的摩尔比为1∶2,室温下作用30min,防止过量的碘乙酰胺烷基化非胱氨酸残基;步骤六:胰酶消化:加入1mL 25mM碳酸氢铵溶液稀释尿素,使其终浓度小于1M,然后加入100μL 1 ...
【技术特征摘要】
1.同位素稀释质谱法定量检测血清低丰度蛋白前处理流程,其特征在于:它的步骤如下:步骤一:高丰度蛋白去除:将100μL血清按试剂说明书步骤用Albumin & IgG Depletion Kit去除绝大部分白蛋白和IgG,取180μL去除高丰度蛋白后的血清,并与70μL 25mM的碳酸氢铵溶液混合;步骤二:变性:将上述混合样本首先在100℃水浴下热变性5min,再冰浴5min冷却,然后加入约96.1mg尿素进行化学变性,漩涡30s后静置5min,最后加入250μL 25mM碳酸氢铵溶液稀释;步骤三:还原:加入50μL 100mM二硫苏糖醇,60℃水浴30min,使变性蛋白已打开的二硫键保持还原状态;步骤四:烷基化:加入50μL 550mM碘乙酰胺,黑暗中室温下作用30min,使半胱氨酸上的巯基烷基化,防止二硫键的形成;步骤五:终止烷基化:加入...
【专利技术属性】
技术研发人员:季伙燕,王建新,王惠民,鞠少卿,丛辉,王旭东,苏建友,
申请(专利权)人:季伙燕,
类型:发明
国别省市:江苏;32
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