一种肝癌靶向光热治疗剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种肝癌靶向光热治疗剂及其制备方法与应用，属于生物医学工程领域。本发明专利技术的肝癌靶向光热治疗剂通过以下方法制备得到：(1)制备生物素化纳米微泡；(2)制备Cy7荧光标记的生物素化抗GPC3抗体；(3)制备生物素化还原性氧化石墨烯(RGO)；(4)通过生物素‑亲和素系统将上述三个步骤制得的产物偶联得到肝癌靶向光热治疗剂。本发明专利技术的光热治疗剂具有超声和荧光成像双重功能，通过超声靶向微泡破坏技术介导RGO靶向投递，实时监控光热治疗进程，该光热治疗剂可用于制备治疗肝癌的药物，具有优异的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学工程
，具体地，涉及一种肝癌靶向光热治疗剂及其制备方法与应用。
技术介绍
肝细胞肝癌(HCC)在世界癌症发病率中占第6位，死亡率占第3位。虽然肝癌以手术治疗为主，但只有9％～29％的患者能够手术切除。光热治疗(Photothermal therapy，PTT)是近年来发展的一种非侵入性热消融治疗技术，主要是以具有光吸收能力的物质充当光热治疗剂，在激光照射下使其局部温度升高来杀伤肿瘤细胞。肿瘤血管由两部分组成，一部分是宿主固有的血管，在肿瘤生长的过程中，宿主局部的微血管大部分被破坏，仅有动脉和较大的静脉可能保留下来，成为肿瘤血管系统的主干，该部分血管通透性正常，其管壁的最大孔径不超过100nm；另一部分是肿瘤新生血管，其结构不完善，基底膜不完整，管壁薄且缺乏平滑肌层，通透性明显升高，其管壁的最大孔径约380～780nm，有时血管外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连。纳米级微泡可以有效的通过孔径约380～780nm的血管壁进入肿瘤组织内部，更加高效的转运光热治疗剂。但一般纳米微泡对肿瘤组织的特异性较差，不能保证靶部位较高的光热治疗剂浓度。理想的光热治疗剂应该在近红(外光区域650-950nm)具有较强的吸收，低毒性，表面可以连接上功能基团实现肿瘤的主动靶向治疗。PTT作为一种非侵入性热消融技术，可实现癌细胞的选择性杀伤，降低对正常细胞和组织的损伤。还原性氧化石墨烯(RGO)的光热治疗疗效肯定，但RGO无法独立显像且无主动靶向能力。RGO光热治疗作为一种有潜力的创伤小的肿瘤治疗技术，得到了广泛关注。然而，在治疗前需要通过合适的成像技术来确定肿瘤的位置、大小及光热治疗剂的体内分布情 况和其在肿瘤部位的富集情况；在治疗中需要影像监测肿瘤部位及周边正常组织的温度变化，以保证良好的消融疗效并避免对周围正常组织的损伤；在治疗后通过成像技术来评价PTT效果。因此，若能够对RGO光热治疗剂优化升级，得到可同时应用于超声-荧光双模态成像和治疗的新型多功能诊疗一体化光热治疗剂，以实现肿瘤的可视化光热治疗，将会大大提高肝癌的临床治疗效果，减轻患者痛苦。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可应用于超声的荧光成像肝癌靶向光热治疗剂及其制备方法与应用。本专利技术首先提供了一种肝癌靶向光热治疗剂的制备方法，包括以下步骤：(1)制备生物素化纳米微泡；(2)制备Cy7荧光标记的生物素化抗肝癌细胞膜高表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)抗体；(3)制备生物素化还原性氧化石墨烯；(4)通过生物素-亲和素系统将上述三个步骤制得的产物偶联得到肝癌靶向光热治疗剂。本专利技术制备肝癌靶向光热治疗剂的技术方案参见图1。本专利技术的上述方法中，步骤(1)制备生物素化纳米微泡是将二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)、生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000-biotin)的混合物溶解于氯仿和甲醇的混合溶液中，蒸干，加入PBS缓冲液复溶，移液到离心管中，密封，将内部空气置换为温室气体；振荡、水浴、超声匀质器处理、温育后继续超声处理，静置浮集上层微球即为生物素化纳米微泡。进一步地，所述温室气体为全氟丙烷(C3F8)。进一步地，步骤(1)中DSPC、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-biotin 的混合物是指三者按照质量比为18：1：1混合；氯仿和甲醇的混合溶液是指二者的体积比为2-2.5:1；所述PBS缓冲液pH值为7.4，浓度为0.15mol/l；所述水浴的温度为50-60℃；水浴后的超声匀质器处理时间不超过30秒；温育温度为50-60℃，继续超声处理的时间为1-2.5分钟。优选地，DSPC、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-biotin的混合物是指三者的质量比为18：1：1；氯仿和甲醇的混合溶液是指二者的体积比为2:1；所述PBS缓冲液pH值为7.4，浓度为0.15mol/l；所述水浴的温度为55℃；水浴后的超声匀质器处理时间20秒；温育温度为55℃，继续超声处理的时间为2分钟。步骤(1)中使用超声均质器处理有利于使微米级微泡向纳米级微泡转化，有利于减小微泡粒径，并且使体系中的纳米微泡更加均匀、稳定。本专利技术方法中，步骤(2)所述的Cy7荧光标记的生物素化抗GPC3抗体是通过以下方法制备得到的：①生物素化抗GPC3抗体购自英国ABCAM公司；②配置交联反应液：精确称取NaHCO3粉末0.378g、Na2CO3粉末0.053g、NaCl粉末0.368g于50ml容量瓶中，加无菌双蒸水定容至50ml；③Cy7粉末溶于DMSO中，浓度1mg/ml，全程避光操作；④将抗体以2mg/ml的浓度溶于交联反应液中，按抗体与Cy7质量比为1mg比150μg的比例反应，将Cy7荧光染料缓慢加入抗体交联反应液中，轻轻摇晃混匀，避光4℃反应8小时；⑤滴加5mol/L的NH4Cl溶液25uL终止反应，避光4℃继续反应8小时；⑥所得交联反应液通过葡聚糖凝胶G10层析柱避光分离纯化，使用冷冻干燥机将滤液避光冻干，所得冻干粉即所制备的Cy7荧光标记生物素化抗GPC3抗体。本专利技术采用葡聚糖凝胶G10层析柱能够实现最大程度分离纯化Cy7荧光标记抗GPC3抗体，较其他层析柱能够取得最佳的分离纯化效果。本专利技术方法中，步骤(3)所述的生物素化还原性氧化石墨烯通过以下方法制备得到，将生物素化聚乙二醇与2mg/mL还原性氧化石墨烯溶液按照质量比1:10比例混合后超声处理80-100min，然后离心去除不稳定的RGO，取上清液，用滤膜过滤去除多余的生物素化聚乙二醇，得到具有生物相容性的生物素化还原性氧化石墨烯RGO-PEG-Biotin。优选地，超声处理时间为90min。采用超声匀质器，20kHz进行超声处理。本专利技术方法中，步骤(4)的偶联方法包括以下步骤：①调整步骤(1)制得的生物素化纳米微泡浓度为1×108-3×108/ml)，加入过量的链霉亲和素混匀，37℃下反应30min，得到溶液1；②再将步骤(2)制得的Cy7荧光标记的生物素化抗GPC3抗体调整至浓度1-1.5mg/ml后，逐滴加入溶液1中，前后二者的体积比为4:1，混匀，37℃下反应30min；离心，吸取下层清液，洗去未结合的抗体得到溶液2；③然后在溶液2中加入过量的生物素化还原性氧化石墨烯(RGO-PEG-Biotin)，4℃静置30分钟；④用PBS冲洗，洗去未结合的RGO-PEG-Biotin，形成携载抗GPC3抗体和RGO-PEG-Biotin的纳米级超声微泡，即为肝癌靶向光热治疗剂。本专利技术提供了上述制备方法制备得到的肝癌靶向光热治疗剂。本专利技术还提供了上述肝癌靶向光热治疗剂在制备治疗或诊断肝癌药物中的应用。进一步地，本专利技术提供一种治疗肝癌的药物，含有本专利技术所述的肝癌靶向光热治疗剂。本专利技术制备得到的光热治疗剂具有超声和荧光成像双重功能，通过超声靶向微泡破坏技术介导RGO靶向投递，能够实时监控光热治疗进程，可用于制备治疗肝癌的药物，具有优异的临床应用价值。附图说明图1为本专利技术制备肝癌靶向光热治疗剂的方法流程图。图2为肝癌靶向光热治疗剂的粒径测试结果，该结果显示复合物平均直径为(3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝癌靶向光热治疗剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备生物素化纳米微泡；(2)制备Cy7荧光标记的生物素化抗GPC3抗体；(3)制备生物素化还原性氧化石墨烯；(4)通过生物素‑亲和素系统将上述三个步骤制得的产物偶联得到肝癌靶向光热治疗剂。

【技术特征摘要】
2015.07.01 CN 20151037733071.一种肝癌靶向光热治疗剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备生物素化纳米微泡；(2)制备Cy7荧光标记的生物素化抗GPC3抗体；(3)制备生物素化还原性氧化石墨烯；(4)通过生物素-亲和素系统将上述三个步骤制得的产物偶联得到肝癌靶向光热治疗剂。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)制备生物素化纳米微泡是将DSPC、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-biotin的混合物溶解于氯仿和甲醇的混合溶液中，蒸干，加入PBS缓冲液复溶，密封，将内部空气置换为温室气体；振荡、水浴、超声匀质器处理、温育后继续超声处理，静置浮集上层微球即为生物素化纳米微泡。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，DSPC、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-biotin的混合物是指将三者按照质量比为18：1：1混合；氯仿和甲醇的混合溶液是指二者的体积比为2-2.5:1；所述PBS缓冲液pH值为7.4，浓度为0.15mol/l；所述水浴的温度为50-60℃；水浴后的超声匀质器处理时间不超过30秒；温育温度为50-60℃，继续超声处理的时间为1-2.5分钟。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，DSPC、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-biotin的混合物是指三者的质量比为18：1：1；氯仿和甲醇的混合溶液是指二者的体积比为2:1；所述PBS缓冲液pH值为7.4，浓度为0.15mol/l；所述水浴的温度为55℃；...

【专利技术属性】
技术研发人员：程文，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23