一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法技术

一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法，属于莱菔素生产领域。本发明专利技术以萝卜籽粕为原料，经过乙醇提取、制备色谱、反应分离、真空干燥等生产得到高纯度莱菔素。本发明专利技术方法具有不需要使用氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂，操作简单，产品纯度高，废弃物有效循环利用，提取纯化效率高，无“三废”排放等特点。本发明专利技术在生产过程中，使用固定化酶作为催化剂，大大提高了酶的利用率。同时创新组装出反应-分离耦合柱式反应器，可进行连续操作、反复使用。本发明专利技术提供生产莱菔素的方法纯化效率高，产品的纯度高达98％以上，且无溶剂残留。采用本发明专利技术方法生产出的产品，可广泛应用于医药、保健等行业中。

【技术实现步骤摘要】
一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法一、
本专利技术属于生产莱菔素的
，特别涉及一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法。二、技术背景近年来，全球癌症患者人数在大幅度增加，而每年我国新增癌症患者占到全球新增病例的20％以上。因此，癌症已经成为人类不容忽视的一种疾病。萝卜籽中含有丰富的硫苷，其中，4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷在萝卜籽中的含量最高，经过黑芥子酶酶解后可生成4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基异硫氰酸酯(俗称莱菔素，sulforaphene)。莱菔素与萝卜硫素相比，在结构上，莱菔素在烃基链上有一个不饱和键；在性能上，莱菔素抑制突变的活性是萝卜硫素的1.3～1.5倍。据相关研究报道，莱菔素对食道癌、结肠癌、乳腺癌等表现出良好的抗癌活性。现有生产莱菔素的方法，如2014年10月8日公开的公开号为CN104086467A“一种利用溶剂萃取法和分子蒸馏法联合制备莱菔素的方法”的专利技术专利，该专利公开的方法是：利用有机溶剂从莱菔素水解液中萃取并减压蒸馏得到莱菔素粗提物，再利用分子蒸馏分离纯化技术纯化得到高纯度的莱菔素产品。该方法存在的主要缺点有：①萃取过程中使用氯仿、二氯甲烷等有毒试剂，不但造成环境污染，而且萃取选择性较低。②分子蒸馏过程中温度较高、受热时间过长，极易造成莱菔素降解，影响产品质量。⑧分子蒸馏设备昂贵，投资成本大，技术要求较高，生产能力有限。④采用萝卜籽或萝卜芽苗作为原料成本较高，且造成萝卜籽中萝卜籽油的极大浪费。三、
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有生产莱菔素方法的不足之处，提供一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法，具有不需要使用氯仿、正己烷等有机试剂，操作简单，产品纯度高，废弃物有效循环利用，提取纯化效率高，无“三废”排放等特点。本专利技术机理：用乙醇对萝卜籽粕中的4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷进行提取，经纳滤膜除去提取液中的小分子蛋白、多糖等物质，达到纯化4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷的目的。制备色谱是基于高效液相色谱技术发展起来的，分离效率与纯化倍数高，产品纯度高。4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷与其它物质存在结构差异，在色谱填料上的吸附力不同，用适当的洗脱液进行洗脱分离，可以获得高纯度的4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷。黑芥子酶经溶解、超声预处理，不仅改变了粗酶中各物质表面类型，且可最大程度提高产品稳定性。黑芥子酶通过交联剂丙二醛固定于胺基型树脂，形成固定化黑芥子酶。将固定化黑芥子酶反应柱与装有吸附树脂的分离柱耦联，形成反应-分离耦合柱式反应器，使高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷在黑芥子酶的催化下生成莱菔素，然后吸附于分离柱上，实现莱菔素的生成与分离。本专利技术的目的是这样实现的：一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法，以萝卜籽粕为原料，经过乙醇提取、制备色谱、反应分离、真空干燥等生产得到高纯度莱菔素。其具体的方法步骤如下：(1)制备4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷粗提液以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量(kg)：体积分数为50～60％乙醇溶液的体积(L)之比为1∶6～8的比例，将萝卜籽粕均匀分散于乙醇溶液中，在温度为70℃的条件下，进行第一次浸提，浸提1～2h。第一次浸提完成后，将浸提混合物泵入压滤机进行压滤，分别收集第一次浸提清液和第一次浸提残渣。对于收集的第一次浸提残渣，在同等条件下，进行第二次浸提和压滤，分别收集第二次浸提清液和第二次浸提残渣。对于收集的第二次浸提残渣，因含有丰富的蛋白质，经干燥处理后可用作动物饲料添加剂。对于收集的第二次浸提清液，与收集的第一次浸提清液合并后，再泵入截留分子量为600～800Da的纳滤器中，在0.25～0.35MPa下，进行第一次纳滤分离，直至纳滤截留液的体积为原体积的20～30％时止，分别收集第一次纳滤滤过液和第一次纳滤截留液。对于收集的第一次纳滤截留液，补充去离子水至原体积，在同等条件下，进行第二次纳滤分离，直至第二次纳滤截留液的体积减少为原体积的5～15％时止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液，并将两次收集的纳滤滤过液合并。对于合并的纳滤滤过液即为4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷粗提液，用作下一步处理。对于收集的第二次纳滤截留液，因含有丰富的蛋白质、多糖，经干燥处理后可用作动物饲料添加剂。(2)制备高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液第(1)步完成后，将市售制备色谱填料(SPSC1810μm色谱填料或SMBC1810μm色谱填料)，分散于无水乙醇中，并装配成制备色谱柱，备用。再按照制备色谱柱：第(1)步合并的纳滤滤过液的体积比为1∶3～5的比例，将合并的纳滤滤过液以流速为制备色谱柱体积的3倍/小时的速度，泵入制备色谱柱中，进行吸附上样。上样结束后，在检测波长为280nm，体积分数为30～40％的乙醇溶液为流动相，流动相流速为制备色谱柱体积的3～5倍/小时的条件下，将流动相泵入制备色谱柱中，进行洗脱制备。然后待流动相泵入18～22min时，开始进行收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，待流动相泵入25～30min时，结束收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，分别收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液、制备色谱洗脱液和制备色谱柱。对于收集的制备色谱柱，可再生后重复使用。对于收集的制备色谱洗脱液，经反渗透浓缩回收乙醇，其中截留液含有丰富的硫苷，经冻干后可用于制作保健品等高附加值产品。对于收集的4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，泵入反渗透浓缩器中，在0.15～0.25MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的10～15％为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液。对于收集的第一次反渗透截留液，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的5～8％为止，分别收集第二次反渗透透过液和第二次反渗透截留液。对于收集第二次反渗透截留液，即为高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液，纯度为95.6～98.9％。对于收集的第二次反渗透透过液，与收集的第一次反渗透透过液合并，经减压蒸馏回收乙醇，调配后可继续使用。(3)制备反应-分离耦合柱式反应器第(2)步完成后，以市售黑芥子酶为原料，按照黑芥子酶的质量(g)：缓冲溶液的体积(mL)比为1∶6～8的比例，将黑芥子酶分散于缓冲溶液中，超声波处理10～20min后，进行过滤，分别收集过滤液和滤渣。对于收集的过滤液，用于制备固定化黑芥子酶。对于收集的滤渣，烘干后用作动物饲料添加剂。其中，所述的缓冲溶液为pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液或pH5.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液或pH4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。将市售已活化的胺基型树脂(WA30树脂或SA20A树脂或SA21A树脂)，按照胺基型树脂的质量(g)：收集的过滤液的体积(mL)：丙二醛质量浓度为18％的丙二醛溶液的体积(mL)比为1∶3～5∶0.7～0.9的比例，先将胺基型树脂加入过滤液中，浸泡2～3h，再加入丙二醛溶液，在温度为40～45℃下进行固定化酶反应3～6h。反应完成后通过抽滤机进行抽滤，分别收集抽滤渣和抽滤液。对于收集的抽滤渣，用2倍于抽滤渣体积的去离子水对抽滤渣进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法，其特征在于具体方法步骤如下：(1)制备4‑甲基亚磺酰基‑3‑丁烯基硫苷粗提液以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量：体积分数为50～60％乙醇溶液的体积之比为1kg∶6～8L的比例，将萝卜籽粕均匀分散于乙醇溶液中，在温度为70℃的条件下，进行第一次浸提，浸提1～2h；第一次浸提完成后，将浸提混合物泵入压滤机进行压滤，分别收集第一次浸提清液和第一次浸提残渣；对于收集的第一次浸提残渣，在同等条件下，进行第二次浸提和压滤，分别收集第二次浸提清液和第二次浸提残渣；对于收集的第二次浸提清液，与收集的第一次浸提清液合并后，再泵入截留分子量为600～800Da的纳滤器中，在0.25～0.35MPa下，进行第一次纳滤分离，直至纳滤截留液的体积为原体积的20～30％时止，分别收集第一次纳滤滤过液和第一次纳滤截留液；对于收集的第一次纳滤截留液，补充去离子水至原体积，在同等条件下，进行第二次纳滤分离，直至第二次纳滤截留液的体积减少为原体积的5～15％时止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液，并将两次收集的纳滤滤过液合并；对于合并的纳滤滤过液即为4‑甲基亚磺酰基‑3‑丁烯基硫苷粗提液，用作下一步处理；(2)制备高纯度4‑甲基亚磺酰基‑3‑丁烯基硫苷浓缩液第(1)步完成后，将市售制备色谱填料，即SPS C18 10μm色谱填料或SMB C18 10μm色谱填料，分散于无水乙醇中，并装配成制备色谱柱，备用；再按照制备色谱柱：第(1)步合并的纳滤滤过液的体积比为1∶3～5的比例，将合并的纳滤滤过液以流速为制备色谱柱体积的3倍/小时的速度，泵入制备色谱柱中，进行吸附上样；上样结束后，在检测波长为280nm，体积分数为30～40％的乙醇溶液为流动相，流动相流速为制备色谱柱体积的3～5倍/小时的条件下，将流动相泵入制备色谱柱中，进行洗脱制备；然后待流动相泵入18～22min时，开始进行收集4‑甲基亚磺酰基‑3‑丁烯基硫苷色谱流出液，待流动相泵入25～30min时，结束收集4‑甲基亚磺酰基‑3‑丁烯基硫苷色谱流出液，分别收集4‑甲基亚磺酰基‑3‑丁烯基硫苷色谱流出液、制备色谱洗脱液和制备色谱柱；对于收集的4‑甲基亚磺酰基‑3‑丁烯基硫苷色谱流出液，泵入反渗透浓缩器中，在0.15～0.25MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的10～15％为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液；对于收集的第一次反渗透截留液，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的5～8％为止，分别收集第二次反渗透透过液和第二次反渗透截留液；对于收集第二次反渗透截留液，即为高纯度4‑甲基亚磺酰基‑3‑丁烯基硫苷浓缩液，纯度为95.6～98.9％；(3)制备反应‑分离耦合柱式反应器第(2)步完成后，以市售黑芥子酶为原料，按照黑芥子酶的质量∶缓冲溶液的体积比为1g∶6～8mL的比例，将黑芥子酶分散于缓冲溶液中，超声波处理10～20min后，进行过滤，分别收集过滤液和滤渣；对于收集的过滤液，用于制备固定化黑芥子酶；其中，所述的缓冲溶液为pH 5.0的醋酸‑醋酸钠缓冲溶液或pH 5.6的磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲溶液或pH 4.8的柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲溶液；将市售已活化的胺基型树脂，即WA30树脂或SA20A树脂或SA21A树脂，按照胺基型树脂的质量∶收集的过滤液的体积∶丙二醛质量浓度为18％的丙二醛溶液的体积比为1g∶3～5mL∶0.7～0.9mL的比例，先将胺基型树脂加入过滤液中，浸泡2～3h，再加入丙二醛溶液，在温度为40～45℃下进行固定化酶反应3～6h；反应完成后通过抽滤机进行抽滤，分别收集抽滤渣和抽滤液；对于收集的抽滤渣，用2倍于抽滤渣体积的去离子水对抽滤渣进行洗涤，分别收集洗涤渣和洗涤液；对于收集的洗涤渣，即为制备出的固定化黑芥子酶，4℃保存备用；将制备得到的固定化黑芥子酶装入夹套保温层析柱中，用与固定化黑芥子酶等体积的去离子水进行反冲，然后升温至25～30℃，就得到固定化黑芥子酶反应柱；将市售已活化的吸附树脂，即HP20树脂或AB‑8树脂或D113树脂，分散于去离子水中，并装配成吸附树脂层析柱，再用与吸附树脂层析柱等体积的去离子水进行反冲，就得到了莱菔素分离柱；将固定化黑芥子酶反应柱和莱菔素分离柱进行连接，就组装出反应‑分离耦合柱式反应器，收集备用；(4)制备高纯度莱菔素第(3)步完成后，将第(2)步制得的高纯度4‑甲基亚磺酰基‑3‑丁烯基硫苷浓缩液，泵入第(3)步组装得到的反应‑分离耦合柱式反应器中，在高纯度4‑甲基亚磺酰基‑3‑丁烯基硫苷浓缩液的泵入速度为反应‑分离耦合柱式反应器体积的1～3倍/小时下，进行连续反应；反应结束后，收集柱...

【技术特征摘要】
1.一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法，其特征在于具体方法步骤如下：(1)制备4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷粗提液以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量：体积分数为50～60％乙醇溶液的体积之比为1kg∶6～8L的比例，将萝卜籽粕均匀分散于乙醇溶液中，在温度为70℃的条件下，进行第一次浸提，浸提1～2h；第一次浸提完成后，将浸提混合物泵入压滤机进行压滤，分别收集第一次浸提清液和第一次浸提残渣；对于收集的第一次浸提残渣，在同等条件下，进行第二次浸提和压滤，分别收集第二次浸提清液和第二次浸提残渣；对于收集的第二次浸提清液，与收集的第一次浸提清液合并后，再泵入截留分子量为600～800Da的纳滤器中，在0.25～0.35MPa下，进行第一次纳滤分离，直至纳滤截留液的体积为原体积的20～30％时止，分别收集第一次纳滤滤过液和第一次纳滤截留液；对于收集的第一次纳滤截留液，补充去离子水至原体积，在同等条件下，进行第二次纳滤分离，直至第二次纳滤截留液的体积减少为原体积的5～15％时止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液，并将两次收集的纳滤滤过液合并；对于合并的纳滤滤过液即为4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷粗提液，用作下一步处理；(2)制备高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液第(1)步完成后，将市售制备色谱填料，即SPSC1810μm色谱填料或SMBC1810μm色谱填料，分散于无水乙醇中，并装配成制备色谱柱，备用；再按照制备色谱柱：第(1)步合并的纳滤滤过液的体积比为1∶3～5的比例，将合并的纳滤滤过液以流速为制备色谱柱体积的3倍/小时的速度，泵入制备色谱柱中，进行吸附上样；上样结束后，在检测波长为280nm，体积分数为30～40％的乙醇溶液为流动相，流动相流速为制备色谱柱体积的3～5倍/小时的条件下，将流动相泵入制备色谱柱中，进行洗脱制备；然后待流动相泵入18～22min时，开始进行收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，待流动相泵入25～30min时，结束收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，分别收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液、制备色谱洗脱液和制备色谱柱；对于收集的4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，泵入反渗透浓缩器中，在0.15～0.25MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的10～15％为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液；对于收集的第一次反渗透截留液，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兵，张杰，
申请(专利权)人：广州六顺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44