本发明专利技术涉及基因技术和植物学领域，旨在提供一种烟草尼古丁合成相关长非编码RNA基因及其应用。该基因的序列是SEQ ID NO：1。该基因是用于调节烟草尼古丁合成量，以实现对烟草中烟碱含量的调控。本发明专利技术揭示了烟草eTM基因(Nta-eTM27)通过降解靶向尼古丁合成关键基因(QPT2)的miRNA(Nta-miRNAX27a)而达到调控尼古丁合成的遗传机制。本发明专利技术取得的eTM调控机制，将为烟草尼古丁合成途径关键基因所扮演的角色提供一个更加深入的理解，以便可以更好的改良烟草尼古丁含量性状。
【技术实现步骤摘要】
烟草尼古丁合成相关长非编码RNA基因及其应用
本专利技术属于基因技术和植物学领域；本专利技术涉及调控烟草尼古丁合成相关的一个长非编码RNA基因，其功能作为microRNA的内源靶标模拟物(EndogenousTargetMimics,eTM)，参与烟草尼古丁合成基因的调控。
技术介绍
烟草尼古丁的合成和转运受多个因素的调控，但在分子水平上，对尼古丁的合成代谢途径和转运的研究还未完全透彻。到目前为止，虽然已经鉴定和克隆出一些尼古丁合成途径中的关键基因，如QPT、PMT、MPO等(Dwey和Xie,2013,Phytochemistry；Sierro等,2014,NatureCommunication)，但这些基因是否会被microRNA(miRNA)途径调控进而影响尼古丁的合成及尼古丁的含量尚不是很清楚。内源靶标模拟物是具有抑制miRNA功能的长非编码RNA，该非编码RNA最早被Franco-Zorrilla研究组在拟南芥中发现(2007，NatureGenetics)，他们发现一个不编码蛋白的基因IPS1在磷酸盐饥饿的情况下被诱导表达。IPS1基因中的序列能够与拟南芥中的miR399的序列结合，结合后在miR399的切割位点处形成了一个环状凸起结构，因此IPS1基因无法被切割，但IPS1基因的表达却能将miR399隔绝起来。而miR399真正的靶标基因是PHO2，该基因对维持细胞内蛋白质的产生和降解的平衡及维持细胞的稳态和正常功能方面起着重要作用，因此该eTM对miR399的结合具有重要的生物学意义。内源靶标模拟物是否在尼古丁合成代谢中发挥作用未见报道。利用miRNA及其对应的eTM调控尼古丁合成和转运途径相关的基因对于改良烟草尼古丁含量具有重要的作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种烟草尼古丁合成相关长非编码RNA基因及其应用。该基因是一种抑制烟草尼古丁合成相关非编码miRNA功能的eTM基因(Nta-eTM27)为解决技术问题，本专利技术的解决方案是：提供一种烟草尼古丁合成相关长非编码RNA基因，该基因的序列是SEQIDNO：1。进一步，本专利技术所述的基因的序列包含SEQIDNO:1中的“TGCAAGAACACTAAACCAAAAATA”序列；或者，该基因的序列是通过对SEQIDNO:1中的“TGCAAGAACACTAAACCAAAAATA”序列进行碱基置换、增添或缺失而形成，所述碱基是指“A、T、C、G、U”中的任意一种。(其中“碱基置换、增添或缺失”，即“碱基置换、碱基增添、碱基缺失”是属于遗传学术语。)本专利技术还提供了前述基因的用途，是用于调节烟草尼古丁合成量，以实现对烟草中烟碱含量的调控(将其用于调节烟草尼古丁合成关键基因QPT2的表达，以实现对烟草中烟碱含量的调控)。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术取得的eTM序列可以有效绑定调控烟草尼古丁合成关键基因QPT2的miRNA(Nta-miRNAX27a)(图1、2)，同时获得实验证据证明此eTM的存在，其中烟草打顶处理后靶向尼古丁合成基因QPT2的miRNANta-miRNAX27a显著下调，QPT2基因显著上调，而可以绑定Nta-miRNAX27a的eTM基因(Nta-eTM27)显著上调(附图3-5)。已有研究表明eTM的大量表达可以大规模降解其绑定的miRNA(Wu等，2013，PlantPhysiology)。本研究揭示了烟草eTM基因(Nta-eTM27)通过降解靶向尼古丁合成关键基因(QPT2)的miRNA(Nta-miRNAX27a)而达到调控尼古丁合成的遗传机制。本专利技术取得的eTM调控机制，将为烟草尼古丁合成途径关键基因所扮演的角色提供一个更加深入的理解，以便可以更好的改良烟草尼古丁含量性状。附图说明图1为Nta-miRNAX27a和靶基因QPT2的联配结果图；图2为Nta-miRNAX27a和Nta-eTM27的联配结果图；图3为Nta-miRNAX27a在不同处理(对照，打顶)后的相对表达结果图；图中显示，打顶处理之后，Nta-miRNAX27a表达量显著低于未处理对照组；图4为QPT2在不同处理(对照，打顶)后的相对表达结果图；图中显示，打顶处理之后，QPT2的表达量显著高于未处理对照组。图5为Nta-eTM27在不同处理(对照，打顶)后的相对表达结果图；图中显示，打顶处理之后，Nta-eTM27的表达量显著高于未处理对照组。具体实施方式本专利技术包含了从烟草中发现调控烟草尼古丁代谢miRNA功能的非编码eTM，为进一步的研究该基因在烟草生长发育过程中所扮演的角色提供了一个很好的基础。本专利技术所进行的研究能够帮助我们更好的理解该基因，并进一步分子育种手段(如转基因和分子标记辅助育种)控制烟草合成尼古丁含量。材料和方法1.生物信息学方法鉴定eTM通过使用来自Genbank的烟草EST序列和鉴定的调控烟草尼古丁合成代谢相关的miRNA序列，编写perl脚本进行eTM预测。所编写的perl脚本遵循以下规则：(1)只允许在miRNA5'端序列上的第9到第12个位点出现凸起；(2)eTM中的凸起部分由三个核苷酸组成；(3)在miRNA5'端第2到第8个位点要与eTM完全配对，但允许G/U错配；(4)除了中间凸起部分，其余错配数要≤3，eTM的长度要大于200个核苷酸。2.实验验证eTM1)植物材料和样品准备本专利技术中实验所用的植物组织材料取自烤烟(Nicotianiatabacum)品种“NC89”和宽叶烟草。烟草植株的生长和发育阶段都是在人工气候室中，并保持生长温度在22-25度之间，以尽量减少外界环境因素对烟草尼古丁合成过程中的影响。实验选取的烟草材料为六株生长期在40天左右，生长高度和体型相近的植株。选取其中的三株，对其实行顶部摘除处理；另三株烟草植株则作为该实验的对照。在对烟草植株进行打顶处理后，所有的植株都被放回其原来的生长环境中，并培育48小时以便充分诱导其对于外界损伤机制所产生的防御性的生理反应和尼古丁的诱导合成。48小时后，分别从打顶伤害和对照处理的烟草植株中提取根部组织，为进行下一步的实验做好了准备。2)抽取烟草植株叶片组织总RNA(采用TRIZOL法抽取)(1)剪取0.1g的烟草根部组织，加液氮研磨成粉末；(2)将粉末快速转移至预先加入1ml左右TRIzol抽提液的1.5ml离心管中，上下混匀，充分裂解，室温放置5min；(3)加入0.3ml的氯仿，盖紧离心管盖，剧烈震荡15sec，室温放置2min；(4)4℃，12,000rpm离心15min，取上清至一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置20min；(5)4℃，12,000rpm离心10min，弃去上清液。再用1ml70％酒精清洗沉淀两次；4℃，12,000rpm离心5min；(6)弃去上清，室温干燥。溶于30μlDEPC处理的ddH2O中，用枪头吹打助溶，必要时可在65℃水浴中助溶3-5min，10,000rpm离心3min，取上清，直接用于后续实验或保存于-80℃。3)去除基因组DNA样品中基因组DNA的去除与反转录RT-PCR:利用天根公司的FastQuantRTKitwithgDNas本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种烟草尼古丁合成相关长非编码RNA基因，其特征在于，该基因的序列是SEQ ID NO:1。
【技术特征摘要】
1.一种烟草尼古丁合成相关长非编码RNA基因，...
【专利技术属性】
技术研发人员：樊龙江，王卫娣，李方方，沈恩惠，叶楚玉，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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