基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法技术

本发明专利技术公开了一种基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法，该方法采用在细胞液培养时加入标记物，从而达到实时跟踪细胞分布的目的，在支架材料制作的过程中，混合用于检测成细胞分泌物的试液，达到实时检测干细胞分化进程的目的。通过细胞追踪及细胞分化过程的实时检测，可以对装载细胞的凝胶沉积进行实时的监控，从而方便研究细胞成活和分化与沉积技术各参数（如沉积速度，压电脉冲宽度等）直接的关系，大大缩短了研究周期和成本。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种，该方法采用在细胞液培养时加入标记物，从而达到实时跟踪细胞分布的目的，在支架材料制作的过程中，混合用于检测成细胞分泌物的试液，达到实时检测干细胞分化进程的目的。通过细胞追踪及细胞分化过程的实时检测，可以对装载细胞的凝胶沉积进行实时的监控，从而方便研究细胞成活和分化与沉积技术各参数（如沉积速度，压电脉冲宽度等）直接的关系，大大缩短了研究周期和成本。【专利说明】
本专利技术涉及细胞打印领域，尤其是涉及一种。
技术介绍
快速成型(RP)技术是九十年代发展起来的一项先进制造技术，在计算机的控制下，RP系统可以根据零件的形状，每次制作一个具有一定微小厚度和特定形状的截面，然后再把它们逐层粘结起来，就得到了所需制造的立体的零件。不同公司制造的RP系统所用的成形材料不同，系统的工作原理也有所不同，但其基本原理都是一样的，那就是"分层制造、逐层叠加"。利用快速成型(RP)技术，可以在无需准备任何模具、刀具和工装卡具的情况下，直接接受产品设计(CAD)数据，快速制造出新产品的样件、模具或模型。在生物工程领域，快速成型技术是制造支架(三维细胞支架)的一项很好的技术工具。这些基于模型的技术可以通过在工作台上进行逐层材料沉积，得到多孔3D支架。在构造支架的过程中，每一层都是沉积成可互相渗透的纤维网络(材料和空隙)。这样可以构成一个具有多孔并无相连接的三维支架。一个可控的有空隙支架可以很好的给细胞和组织提供氧气、养料保证组织培养。支架的内部和外部结构可以由CAD或CAM绘制而成。通过这些方式可以生产可替换正常组织并满足其机械性能的3D结构。另外，利用电脑层析成像和核磁共振成像可以得到组织构造的支架。这种生产支架的多样性可以更有利于研究细胞在不同组织支架中的再生情况。近期，利用快速成型制造可以提供细胞生长的三维结构已经可以制造出来了，其目标是可以制造等效活细胞。这项技术，有很多人称之为组织或细胞打印，也可以被定义成多细胞群沉积技术，有望模仿活细胞进行排布。基本原理是设计一个可以更接近真实细胞、基质和生物分子组织的方法，这种方法可以帮助揭示细胞与细胞，细胞与基质关系，并且也可以为功能移植中的细胞再生提供帮助。 目前3D沉积技术对单纯聚合物支架打印技术已日趋成熟，单纯的打印一个符合要求的有机物支架已经不是细胞打印的主要瓶颈。但可以打印出一个可供活细胞生存并正常分化的凝胶支架尚且困难，目前常用的聚合物沉积支架主要缺点有(I)细胞和支架的制作不同步。现代细胞沉积的主要方法是先制作有机聚合物支架，再向支架中注入活细胞，其优点是保证注入活细胞成活率，但缺点是不能控制细胞在支架中的成分和比例，导致支架中细胞的含量由于支架结构的限制而分配不均；(2)细胞成活和分化有失实时性，由于无法在注入过程中实现细胞的实时监测，细胞成活与否只有在细胞完全注入并培育一段时间后，才能检测细胞是否成活和细胞的分化情况。而当所制作支架不满足成活条件时，需要重新制作支架并且重复实验，这就导致真正制作一个符合要求的支架将消耗大量的时间精力。(3)成活率检测为沉积后检测，当细胞注入到支架的过程中，细胞可能在注入的过程死亡，这是由于在细胞被注入及到达支架预定位置的时间段内，细胞并不能得到足够的养分，并且在这段时间里，细胞将受到不同程度的挤压。在诸多外界因素的影响，很有可能导致细胞提前死亡，这样的结果并不能证明支架本身的结构式有问题，对实验结果即会产生偏差。实验结果产生偏差会进而导致更多无效的重复制作支架过程。
技术实现思路
本专利技术提供了一种，在制作过程中实时对细胞成活状态、在支架中的比例以及细胞分化情况进行检测反馈，根据检测数据调整三维细胞支架打印参数，进而得到精确的三维细胞支架。为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案如下:一种，包括:(I)将干细胞置于活体染料的培养皿中培养染色，直至干细胞变色后，将有色干细胞和无色干细胞分离，取出有色干细胞；(2)将染色后的有色干细胞置于凝胶原液中培养，培养完成后，加入凝胶浴液，过滤得到凝胶包裹的干细胞；(3)将步骤(2)得到凝胶包裹的干细胞装入三维打印装置的注射器中，进行三维细胞支架打印，打印过程中，根据有色干细胞的分布情况实时读取三维细胞支架上有色干细胞的分布信息，最后固化得到三维细胞支架；(4)将得到的三维细胞支架放置20-48小时后，浸入到干细胞初期分化检测试剂中，检测三维细胞支架上干细胞初期分化信息；(5)将得到的三维细胞支架放置10-15天，利用蛋白检测设备检测三维细胞支架上干细胞后期分化信息；(6)最后进行如下判断:若制备得到三维细胞支架符合要求，则完成打印过程；若制备得到三维细胞支架不符合要求，则将步骤(3)得到的三维细胞支架上有色干细胞的分布信息、步骤(4)得到的三维细胞支架上干细胞初期分化信息、以及步骤(5)得到的三维细胞支架上干细胞后期分化信息作为反馈信息，调整步骤(3)中三维打印装置打印参数，重复步骤(I) - (6)。下面对上述技术方案的几种优选方案做进一步说明:本专利技术所使用的干细胞，可选择各种干细胞，例如可采用骨骼干细胞、造血干细胞等。本专利技术中的三维细胞支架打印方法包括细胞培养部分和有机物支架制作部分:有机物支架一般选择凝胶类有机物，如海藻盐等可以有效抗紫外辐射及电磁影响的有机材料，除了有机物以外，支架部分还应含有分化细胞对应的蛋白酶和检测试液，如酚酞等酸碱检测溶液。步骤(I)中，所述的培养染色过程中，可采用的染料为能够标记成活干细胞的活体染料，常见的活体染料可选择健那绿B或中性红的生理盐水溶液，活体染料的浓度可根据实际需要确定，活体染料浓度过高，会导致干细胞的粘度过大，最后形成的凝胶容易堵塞打印装置的打印喷头，不利于后续的打印操作；浓度过低，染色效果不佳；作为优选，所述的健那绿B或中性红的重量百分比浓度为0.01-0.05%。步骤(I)中，所述的将有色干细胞和无色干细胞分离操作可选择通过离心分离；相对于活细胞，死细胞由于失水，密度相对降低，大部分死细胞会漂浮在活体染料的生理盐水溶液中，通过离心作业，可快速实现活细胞和死细胞的分离，提高分离效率和分离质量。步骤(2)中，所述的凝胶原液一般选择海藻酸钠水溶液，所述的海藻酸钠水溶液中海藻酸钠浓度可根据实际需要调整，实验证明，当海藻酸钠的浓度过高时，形成凝胶容易导致打印喷头堵塞，不利于后续的打印操作；当海藻酸钠的浓度过低时，由于凝胶浓度较稀，打印线条容易产生扩散，降低了打印精度；作为优选，所述海藻酸钠水溶液中海藻酸钠的重量百分比浓度为2-5%，选择该浓度时，凝胶更容易成型，提高了整体打印效率和打印质量。另外，由于离子会促进凝胶海藻酸钠的固化，所以在配置凝胶原液时，为避免凝胶原液发生固化，作为优选，配置海藻酸钠水溶液时，采用去离子水。步骤(2)中，所述的凝胶浴液一般选择CaCl2水溶液，所述的CaCl2水溶液的浓度可根据实际需要调整，实验证明，CaCl2水溶液的浓度也不易过高过低，CaCl2水溶液的浓度过高和过低均不利于后续打印操作。作为优选，所述的CaCl2A溶液中CaCl2的质量百分比浓度为2-5%。步骤(2)中，有色干细胞置于凝胶原液中培养的时间可根据实际需要确定，一般保证有色干细胞充分适应凝胶环境，降低干细胞后续的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法，其特征在于，包括：（1）将干细胞置于活体染料的培养皿中培养染色，直至干细胞变色后，将有色干细胞和无色干细胞分离，取出有色干细胞；（2）将染色后的有色干细胞置于凝胶原液中培养，培养完成后，加入凝胶浴液，过滤得到凝胶包裹的干细胞；（3）将步骤（2）得到凝胶包裹的干细胞装入三维打印装置的注射器中，进行三维细胞支架打印，打印过程中，根据有色干细胞的分布情况实时读取三维细胞支架上有色干细胞的分布信息，最后固化得到三维细胞支架；（4）将得到的三维细胞支架放置20?48小时后，浸入到干细胞初期分化检测试剂中，检测三维细胞支架上干细胞初期分化信息；（5）将得到的三维细胞支架放置10?15天，利用蛋白检测设备检测三维细胞支架上干细胞后期分化信息；（6）最后进行如下判断：若制备得到三维细胞支架符合要求，则完成打印过程；若制备得到三维细胞支架不符合要求，则将步骤（3）得到的三维细胞支架上有色干细胞的分布信息、步骤（4）得到的三维细胞支架上干细胞初期分化信息、以及步骤（5）得到的三维细胞支架上干细胞后期分化信息作为反馈信息，调整步骤（3）中三维打印装置打印参数，重复步骤（1）?（6）。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贺永，夏冰，傅建中，赵朋，金育安，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：