表位肽制造技术

本发明专利技术涉及蛋白质领域，特别涉及表位肽及其运用，所述表位肽为含有的氨基酸序列为WETEERPRTREE的人工合成肽，运用该肽制备的特异性单克隆抗体效价高，可用于制备检测糖尿病的特异性诊断试剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学免疫学领域，特别涉及一种B细胞表位肽及其应用。
技术介绍
糖尿病(diabetes mellitus, DM)定义:由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，伴有因胰岛素分泌和/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢异常。该病在临床上的主要病征为“三多一少”，即多饮、多食、多尿、体重减轻。2型糖尿病:以胰岛素抵抗为主，伴胰岛素分泌不足，至以胰岛素分泌不足为主伴胰岛素抵抗(WH01999标准)。2型糖尿病的致死率的预测一直是一个难题。第47届欧洲糖尿病研究学会年会(EASD2011)上报告的荷兰一项针对2型糖尿病患者初级保健的前瞻性观察研究表明，循环过氧化物氧化还原酶4(peroxiredoxin-4,Prx4)水平的增加与2型糖尿病患者的心血管和全因死亡率独立相关。但是，目前临床上还不存在一种基于Prx4的糖尿病检测试剂。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种B细胞表位肽及其蛋白载体，其能过氧化物氧化还原酶4单克隆抗体的特异性抗原。实现上述目的的技术方案为:表位肽， 所述表位肽为含有的氨基酸序列为WETEERPRTREE的人工合成肽，即如SEQ ID NO: I所示。含有上述氨基酸序列的表位肽具体为:WETEERPRTREEE。优选的，所述表位肽与BSA、0VA、肌红蛋白、KLH和破伤风类毒素任一种蛋白载体连接，得含有所述表位肽的蛋白载体。本专利技术的目的之二在于提供一种杂交瘤细胞，其能特异性的分泌过氧化物还原酶4单克隆抗体。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为:所述所述表位肽制备的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞的制备是通过所述B细胞表位肽段与BSA或KLH交联后免疫Balb/c小鼠，取免疫后的小鼠小鼠脾细胞悬液并制备SP2/0细胞悬液(脾脏B淋巴细胞)，并与骨髓瘤细胞和融合，将融合细胞选择性培养，通过ELISA筛选后得到的杂交瘤细胞。将筛选出的阳性细胞进行克隆化培养，同时在克隆化培养的杂交瘤细胞中筛选出阳性化的杂交瘤细胞送于并送中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏号为CCTCC C2012148，其可稳定分泌所述单克隆抗体。本专利技术的目的之三在于提供表位肽单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体可作为检测过氧化物还原酶4的特异性诊断试剂，其应用为类风湿关节炎的诊断及2型糖尿病的预测提供了新方法。实现上述目的的技术方案为:所述表位肽的特异性单克隆抗体。所述特异性单克隆抗体由生物保藏编号为CCTCC C2012148的杂交瘤细胞分泌。所述的特异性单克隆抗体在制备诊断二型糖尿病或类风湿关节炎诊断试剂中的应用。所述的表位肽在制备诊断二型糖尿病诊断试剂中的应用。有益效果I)抗Prx4单克隆抗体的制备:通过生物信息学分析，综合考虑蛋白质的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性及柔韧性，预测HBV LHBs中preSl区段中的潜在B细胞表位，发现新的B细胞表位区域83aa_lIIaa (肽2)，人工合成上述两种B细胞表位多肽，与BSA交联后通过新型免疫程免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术经多次细胞融合，利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗Prx4单克隆抗体的杂交瘤细胞株并检测其细胞培养上清的效价。之后对杂交瘤细胞核型分析，明确染色体数目，证实杂交瘤确实是小鼠脾细胞和SP2/0融合而成，再进行抗体亚类鉴定和抗体的特异性实验，证实得到的抗体是特异性针对Prx4 的 ο2) Prx4重组蛋白的制备:从GENBANK中获得人Prx4编码序列，通过密码子偏性改造，同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子获得编码序列，进行Prx4全长基因的合成制备；将Prx4基因与载体连接·,获得Prx4重组质粒；将Prx4重组质粒转化大肠杆菌,诱导表达获得Prx4重组蛋白；鉴定重组蛋白的可溶性后纯化重组蛋白并进行纯度、浓度和活性鉴定，得到了高纯度的Prx4重组蛋白，可以用于筛选抗Prx4杂交瘤细胞。3)制备抗Prx4特异性兔多克隆抗体:用从血清中分离纯化得到的Prx4免疫新西兰大白兔，经过多次免疫，待兔血清中的抗Prx4抗体达到较高效价后放血，经过抗原亲和层析纯化后得到了高效价、高亲和力的特异性的多克隆抗体。更多有益效果，详见具体实施方式。本专利技术中杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株Prx-4送中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏编号为CCTCC C2012148，地址位于中国武汉武汉大学，保藏的培养物名称为小鼠杂交瘤细胞。具体实施例方式实施例1多克隆抗体的制备一重组蛋白I编码Prx4基因成熟肽cDNA的克隆和验证利用Trizol Reagent提取糖尿病患者血细胞的总R N A,并反转录成cDNA。设计引物 Prx4F:5，_gctagcatgagcaacactgtccc a~3'和 Prx4R:5' -gaattcgaagtattctttgctgcc a~3'，以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，以获得编码该基因成熟肽的基因片段。PCR反应程序:94°C变性4min，I个循环；94°C变性50s，55°C退火50秒，72°C延伸I分钟，35个循环；72°C延伸10分钟，I个循环。PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，经过凝胶成像系统观察照相后切下特异目的条带，用D N A凝胶回收试剂盒纯化目的片段，连入P M D18-T载体，转化ToplOF’感受态细胞，然后通过PCR筛选阳性克隆并进行测序验证。2重组表达载体构建构建重组表达载体:将构建好的表达载体转化大肠杆菌T0P10F’感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素(lOOyg/mL)的L B平板，过夜培养，以基因特异性引物Prx4与载体引物 Reverse T7Promoter (5' -tagttattgctcagcggtg g-3')对转化子进行筛选。挑选阳性克隆，进行测序。3重组表达载体转化宿主菌将经过测序鉴定正确的阳性克隆转入含有氨苄青霉素(100 μ g/m L)的L B液体培养基中，200转/分钟，37°C培养过夜。利用EZ Spin Colunm Plasmid Min1-Pr印skit提取质粒，取IOng质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)plys S感受态细胞。将转化产物接入IOmL的L B培养基中(含100 μ g/m I氨苄青霉素，34 μ g/m I氯霉素)，200转/分钟，37°C培养过夜。4重组蛋白的诱导表达取0.5m L过夜培养的菌液接入5m L新鲜的L B培养基中(含100 μ g/m L氨苄青霉素，34 μ g/m L氯霉素)，200转/分钟，37°C培养2_3小时，待其OD45tl达到0.5-0.8小时，加入终浓度为0.lmmol/L的I P T G继续培养6小时，每隔I小时取样一次，每次取500 μ L。将收集到的培养液分别于4°C，12000转/分钟条件下离心2分钟，弃上清，然后将菌泥保存于-20°C，备用。5表达产物的初步分析在每个样品中加500 μ L裂解液处理，在液氮与42°C水浴中反复冻融，离心后通过SDS-PAGE分析上清与 沉淀中的蛋白，同时对IPTG诱导不同时间目的蛋白的表达量进行分析。6分离纯化称量回收菌体的湿重，按每克菌体IOm L的比例加入Buffer (50mmol/L磷酸钠，6mol/L盐酸胍,300m本文档来自技高网...

【技术保护点】
表位肽，其特征在于：所述表位肽为含有的氨基酸序列为WETEERPRTREE的人工合成肽，即如SEQ?ID?NO∶1所示。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈志新，熊新，
申请(专利权)人：张华，
类型：发明
国别省市：