一种基于荧光检测原理的芳香化酶抑制剂高通量筛选模型制造技术

一种利用均相时间分辨荧光技术实现的芳香化酶抑制活性高通量筛选，通过检测激发光照射后的反应体系中荧光强度比值(665nm/610nm)，经过公式换算，可以判断待测样品对芳香化酶的抑制活性，利用本发明专利技术的高通量筛选新模型，可规避使用基于放射性配基结合原理的实验方法对实验人员与环境的危害，且具有高效、快速、准确、廉价的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药理学领域，利用均相时间分辨荧光检测技术，构建了体外芳香化酶抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对芳香化酶抑制活性的高通量检测。
技术介绍
留体A环芳香化酶主要存在于卵巢和胎盘中，也见于其它组织，如脑、肾上腺、睾丸、骨髓、脂肪、皮肤、肌肉及某些肿瘤组织。芳香化酶以雄激素为底物，在氧和NADPH参与下，于底物的19位进行两次羟基化，最终使A环芳香化生成雌激素产物。抑制芳香化酶的活性或使其失活可导致体内雌激素水平降低，从而使与雌激素有关的生理过程如排卵、着床等受到干扰，也可使雌激素维持的疾病如某些乳腺癌、子宫内膜癌、女子性早熟、男子女性型乳房等得到治愈或缓解。由于芳香化酶所催化的反应是各类留体激素生物合成的最后步骤，因而阻止这步反应将不降低其它激素的分泌水平，如果芳香化酶抑制剂本身没有明显的激素活性，那么可以预期，芳香化酶抑制剂用于临床将具有较小的毒副作用。因此，研究芳香化酶抑制剂具有重大意义。近年来，大量能够干扰或者损害人类和野生动物内分泌系统并导致肿瘤形成的环境化学物质引起了人们的广泛关注，包括一些外源性雌激素以及抗雄激素和抗甲状腺的化学物质，如杀虫剂，能够阻断或者激活留体激素受体，影响性激素水平并干扰内分泌，从而影响雄性和雌性生殖系统的发育，因此对这些化学物质的拟激素活性进行筛选，建立评价化学物质内分泌干扰活力的检测体系相当重要。故建立快速高效准确的芳香化酶筛选模型具有重要意义。时间分辨突光技术(time-resolved fluorescence, TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm，且供体发 射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均相时间分辨突光(homogeneous time-resolved fluorescence, HTRF)技术是法国 Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒)，为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体，受体经过别藻蓝蛋白(al1phycocyanin)或突光素修饰,供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧光引起的背景干扰。运用均相分辨荧光技术建立雌二醇的定量分析方法，而雌二醇是芳香化酶的催化产物，通过检测反应体系中雌二醇的含量，从而达到测定待测样品对芳香化酶活性影响的目的，最终通过对酶和底物浓度、抗体孵育时间等反应条件的优化和反应体系的微量化，可以实现对芳香化酶抑制剂的高通量筛选模型的建立。目前，已有多种芳香化酶抑制剂的筛选方法，例如同位素结合实验，包括TLC薄层层析法和[3H]掺入法，然而，同位素检测对于实验条件要求很高，而且会破坏环境及损害实验人员的健康；也可以利用ELISA法或者高效液相法测定反应产物来筛选芳香化酶抑制齐U，但是此方法费时费力，难以做到高通量筛选。因此，建立非放射性的检测方法，特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种基于荧光的芳香化酶抑制剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。本专利技术的技术方案:运用均相时间分辨荧光的方法检测芳香化酶与底物及辅酶孵育后的反应体系中荧光强度比值(665nm/610nm)，该比值可反映最终反应体系中雌二醇的含量，从而达到测定芳香化酶活性的目的，最终实现待测样品对芳香化酶抑制活性的高通量筛选。本专利技术利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种芳香化酶抑制剂高通量筛选模型。步骤一:芳香化酶抑制剂筛选模型的建立与优化。步骤二:阳性药验证模型可靠性。步骤三:高通量筛选模型验证。附图说明:图1:芳香化酶浓度梯度优化实验结果。(η = 3， 土5 ) 图2:芳香化酶温孵时间优化实验结果。(n = 3,x±s )图3:芳香化酶底物浓度优化实验结果。(η = 3，[土？)图4:芳香化酶NADPH浓度优化实验结果。(η = 3， 土S )图5:阳性药来曲唑对芳香化酶的抑制曲线图。(11 = 3八土^)图6:芳香化酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。图7:高通量筛选Z'值分布。具体实施例方式以下结合附图说明本专利技术的具体实施方式:1.芳香化酶活性检测I)实验材料雌二醇检测试剂盒(Cisbio,法国)、睾酮(Sigma-aldrich,美国)、NADPH(罗氏，美国)、来曲唑(美仑，中国)、384低体积白板(Corning，美国)、人源芳香化酶(BD，美国)、枪头(Axygen,美国)。2)实验步骤 进行芳香化酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、NADPH浓度实验，见图1_4。 待测化合物精确称量，加入DMSO溶剂成母液，然后使用检测缓冲液配制待测化合物溶液至所需浓度，初筛浓度约为I X 10_3mol/L。 在反应容器中每孔加入芳香化酶溶液2 μ 1，底物溶液2 μ I，缓冲液或待筛化合物 4μ l，NADPH2y I。37°C反应 I 小时。 每孔加入 Estradiol_XL6655 μ I, Ant1-Estradiol-cryptate5 μ I，室温孵育 2小时。 利用美国贝克曼库尔特(Beckman Coulter)公司检测平台HTRF模块分别检测665nm和610nm处的突光强度。 绘制阳性药来曲唑量效曲线并测定其IC5tl值，见图5。 采集检测信号并绘图，通过信号窗和V值确定高通量筛选模型的可靠性，见图6，7。2.数据处理I)根据公式计算各孔665nm和610nm处荧光强度的比值(Ratio665/610)；2)根据公式计算各孔的相对抑制率本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种芳香化酶高通量筛选模型，其特征在于该模型的筛选方法是运用均相时间分辨荧光的方法检测芳香化酶与底物及辅酶孵育后的反应体系中荧光强度比值(665nm/610nm)，该比值可反映最终反应体系中雌二醇的含量，从而达到测定芳香化酶活性的目的，最终实现待测样品对芳香化酶抑制活性的高通量筛选。

【技术特征摘要】
1.一种芳香化酶高通量筛选模型，其特征在于该模型的筛选方法是运用均相时间分辨荧光的方法检测芳香化酶与底物及辅酶孵育后的反应体系中荧光强度比值(665nm/610nm)，该比值可反映最终反应体系中雌二醇的含量，从而达到测定芳香化酶活性的目的...

【专利技术属性】
技术研发人员：严明，吉金子，苗靖姗，向华，张陆勇，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：