以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，首先对赤石脂分别进行羟基化和硅烷化处理，然后将处理好的赤石脂载体加入到肪酶溶液中，经摇床振荡吸附固定后，用海藻酸盐凝胶对吸附了脂肪酶的赤石脂进行包埋，最后冷冻干燥得到赤石脂固定化脂肪酶。本方法采用的赤石脂具有原料易得，价格低廉的特点，同时也具有很好的物理吸附性和表面化学活性，经过改性以及包埋处理后，能显著提升载体的稳定性，制得的固定化酶酶活力回收率高，稳定性好，而且本发明专利技术的工艺简单，操作成本低，有望推动酶法制备生物柴油的工业化进程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及固定化脂肪酶
，特别涉及。
技术介绍
脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一类特殊的酰基水解酶，能够在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交换等化学反应及高聚物合成和立体异构拆分等有机合成反应，并且在强烈脱水和有机体系中能保持高活性、高稳定性和高区域、立体选择性，因此被广泛应用于油脂水解、油脂改性、皮革加工、造纸工业、洗涤剂工业、制药工业、食品加工、生物能源等方面有着很大的应用潜力，是目前被广泛研究的一种酶催化剂。然而，在实际使用过程中，游离酶即使在最适反应条件下也存在易失活、催化反应不稳定、与产物分离困难或分离成本高等缺点。另外，脂肪酶酶制剂一般是通过微生物发酵产生，或者是从动物、植物体内提取的，分离纯化成本高，导致酶的生产价格较高，加上游离酶很难重复利用，导致酶制剂的使用成本提高，从而限制了游离酶在工业生产中大规模的应用。固定化酶指经物理或化学方法处理后，使酶变成不易随水流失即运动受限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。与游离酶相比，固定化酶的优点有:可多次使用，且酶的稳定性提高；反应完成后，固定化酶易与底物和产物分离，而且酶活力降低较少，这样就降低了生产成本；反应条件易于控制，有利于自动化生产。固定化酶通常所用的载体有活性炭、硅藻土、高岭土、大孔树脂、层状硅酸盐、改性硅胶、氧化铝、壳聚糖、纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯丙烯胶、卡拉胶、海藻酸纳、磁性淀粉微球、分子筛以及复合二氧化硅等。酶的固定化方法常 用的是:吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。在此基础上还出现了上述方法的结合法等。吸附法制备的固定化酶，酶的活性中心不易被破坏而且酶高级结构变化较少，能较好的保持酶的催化活力，但酶与载体之间的结合力较弱，酶容易从载体上脱落下来，而包埋法 采用的凝胶聚合物的网格可以阻止酶的泄漏，同时能让基质渗入和产物扩散出来，通过吸附-包埋法制备固定化酶不仅可以有效保持酶活力，还能提升酶的稳定性。酶固定化研究中，良好的载体是固定化酶成功的关键。所以在酶固定化领域，作为固定化载体的筛选和制备就成为了主要研究方向。赤石脂为硅酸盐类矿物多水高岭石族多水高岭石，主要成分为水化硅酸铝，尚含相当多的氧化铁等物质，其组成如下:硅42.93%、铝36.58%、氧化铁及锰4.85%、镁及钙0.94%、水分14.75%。赤石脂与高岭土极其相似，具有很强吸附能力。由于目前赤石脂作为一种传统中药材，主要在中医中使用，而利用其作为固定化载体国内外还没人研究，所以利用赤石脂作为固定化载体固定脂肪酶具有较大的理论和实践意义；而本方法研究的目的是开发赤石脂的应用领域，并可以增强赤石脂在工业、医学、环境保护等领域的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，该方法工艺简单，操作成本低、稳定性好，具有较高催化活力以及酶活回收率。为了解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案得以解决: (1)赤石脂载体的羟基化处理:按每克赤石脂加入6-8ml盐酸的比例，将赤石脂浸溃于盐酸溶液中，并于35-40°C振荡反应过夜，然后用去离子水洗涤至中性，烘干； (2)赤石脂载体的硅烷化处理:按每克羟基化处理的赤石脂添加2-4ml石油醚和0.02-0.04 mL硅烷化试剂的比例，在羟基化处理的赤石脂中加入石油醚和硅烷化试剂，充分混匀后，常温下放置于摇床中反应3-5 h，待反应结束后，过滤，滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤3-5次，烘干； (3)脂肪酶的固定化:按给酶量为40-90mg/g的比例(即每克赤石脂给酶量为40-90mg)向脂肪酶溶液中加入硅烷化赤石脂，密封，在20-40°C下振荡固定l_5h后，抽滤，滤渣用缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，冷冻干燥后备用； (4)赤石脂固定化酶的包埋:按每克赤石脂固定化酶加入10-20ml海藻酸盐溶液的比例，向其中加入质量百分比浓度为1-3%的海藻酸盐溶液，充分搅拌均匀。用5号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分比浓度为1-2%的氯化钙溶液中，并在4°C下固化l_3h，抽滤，充分洗涤，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。本专利技术步骤(I)中盐酸浓度为l_3mol/L。本专利技术步骤(2)中硅烷化试剂为甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、N- ( β -氨乙基 )-Y -氨丙基三乙氧基硅烷中的一种。本专利技术步骤(3)中脂肪酶溶液为脂肪酶和pH值为3-8的缓冲液混合制得的溶液，其中缓冲液是浓度为0.02-0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲溶液。缓冲液按常规方法配制，磷酸盐缓冲溶液由磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液配制而成，醋酸盐缓冲溶液由醋酸溶液和醋酸钠溶液配制而成。本专利技术步骤(4)中所述海藻酸盐溶液为海藻酸钠或者海藻酸钙溶液。本专利技术中固定化脂肪酶的评价方法如下: 1、脂肪酶活力测定采用橄榄油乳化法。向锥形瓶中加入4ml橄榄油乳化液和5ml磷酸缓冲液，40 V水浴中预热5min，并设立空白组。加入固定化脂肪酶，混匀，40 V水浴震荡15min。反应结束后，各锥形瓶中加入15ml的95%乙醇终止反应。待测样品加入酚酞指示剂后，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液准确滴定至粉红色。由滴定消耗氢氧化钠的量计算出游离酶及固定化酶的酶活。以在pH为7的缓冲液、温度为40°C的条件下，Imin水解产生I μ mol脂肪酸所需的酶量定义为一个活力单位(U)，酶活力的计算公式如下:C'AV 000U = ~~~~~t.ηι 式中:C--标准NaOH溶液浓度(mol/L)； AV-样品和空白样样品消耗标准NaOH溶液的体积差(mL)； t—反应时间(h)； m—酶的用量(g)。2、固定化酶酶活回收率计算公式如下:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：?（1）赤石脂载体的羟基化处理：按每克赤石脂加入6?8ml盐酸的比例，将赤石脂浸渍于盐酸溶液中，并于35?40℃振荡反应过夜，然后用去离子水洗涤至中性，烘干；（2）赤石脂载体的硅烷化处理：按每克羟基化处理的赤石脂添加2?4ml石油醚和0.02?0.04?mL硅烷化试剂的比例，在羟基化处理的赤石脂中加入石油醚和硅烷化试剂，充分混匀后，常温下放置于摇床中反应3?5h，待反应结束后，过滤，滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤3?5次，烘干；（3）脂肪酶的固定化：按给酶量为40?90mg/g的比例向脂肪酶溶液中加入硅烷化赤石脂，密封，在20?40℃下振荡固定1?5h后，抽滤，滤渣用缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，冷冻干燥后备用；（4）赤石脂固定化酶的包埋：按每克赤石脂固定化酶添加10?20ml海藻酸盐溶液的比例，在赤石脂固定化酶中加入质量百分比浓度为1?3%的海藻酸盐溶液，充分搅拌均匀，用5号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分比浓度为1?2%的氯化钙溶液中，?并在4℃下固化1?3h，抽滤，充分洗涤，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。...

【技术特征摘要】
1.一种以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)赤石脂载体的羟基化处理:按每克赤石脂加入6-8ml盐酸的比例，将赤石脂浸溃于盐酸溶液中，并于35-40°C振荡反应过夜，然后用去离子水洗涤至中性，烘干； (2)赤石脂载体的硅烷化处理:按每克羟基化处理的赤石脂添加2-4ml石油醚和0.02-0.04 mL硅烷化试剂的比例，在羟基化处理的赤石脂中加入石油醚和硅烷化试剂，充分混匀后，常温下放置于摇床中反应3-5h，待反应结束后，过滤，滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤3-5次，烘干； (3)脂肪酶的固定化:按给酶量为40-90mg/g的比例向脂肪酶溶液中加入硅烷化赤石月旨，密封，在20-40°C下振荡固定l_5h后，抽滤，滤渣用缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，冷冻干燥后备用； (4)赤石脂固定化酶的包埋:按每克赤石脂固定化酶添加10-20ml海藻酸盐溶液的比例，在赤石脂固定化酶中加入质量百...

【专利技术属性】
技术研发人员：余旭亚，邓涛，游金坤，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：