RESOLFT显微术中用于照明和探测的方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术涉及一种在RESOLFT显微术中用于照明和探测的方法，采用脉冲或连续的光源以产生激发光和转换光，其特征在于以脉冲的形式照射激发光（4）且激发光（4）的脉冲长度超过150皮秒，优选地长至几百皮秒，长达几纳秒。相应的装置使用根据本发明专利技术的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在RESOLFT显微术中使用用于激发或转换光的脉冲或连续光源进行照明和探測的方法。本专利技术还涉及用于实施本专利技术的方法的装置。
技术介绍
RESOLFT (可逆饱和光(荧光)转移过程)显微术包括ー组能够以高放大率生成特别清晰的图像的光显微方法。尽管使用传统的物镜和衍射光束，但能够获得远超过衍射极限、达到分子尺度的分辨率(具体而言，可參见Stefan ff.Hell, Marcus Dyba及Stefan Jakobs:しoncepts for nanoscale resolution in fluorescence microscopy, Neurobiology 中的 Current Opinion, 2004，14:599-609 页；Stefan W.Hell:Microscopy and its focalswitch, Special Features Perspective,第 6 卷第 I 其月,2009 年 I 月，Nature Methods)。在传统光显微镜中，仅能区分相距约200nm的紧密特征。这是由光的波象性造成的。例如，在传统的光显微镜中，分辨率主要由使用的光的波长和数值孔径来決定。在RESOLFT显微术中，克服了这ー极限。为此，染料被临时地转换至响应于照明而不能发射(荧光)信号的状态。根据上述说明，RESOLFT显微术是克服了衍射极限的光显微术的变型例。因此，使用RESOLFT显微术，能够探测并成像样本中实际上彼此非常接近而难以分辨的特征。在RESOLFT 显微术中，STED 显微术(參见 Stefan ff.Hell, Jan Wichmann:Breakingthe diffraction resolution limit Dy stimulated emission:stimulatea—emission-depletion fluorescence microscopy, Optics Letters.19 卷第 11 器，1994, 780-782页;Thomas A.Klar,Stefan ff.Hel1: Subdiffraction resolution in far-f ieldfluorescence microscopy, Optics Letters,第 24 卷第 14 期，1999，954-956 页)和GSD 显微术(參见 Volker Dose:Peer Review, EPL, A Letters Journal Exploring theFrontiers of Physics,第89卷，2009;Stefan ff.Hell M.Kroug:Ground-state_depletioniluorescence microscopy:a concept forbreaking the diffraction resolutionlimit, Applied Physics B: Lasers and Optics,第 60 卷第 5 期，1995，495-497 页;StefanBretschneider,Christian Eggeling,Stefan W.Hei1:Breaking the diffractionbarrier in fluorescence microscopy by optical shelving,Physical Review Letters,第98卷第5期，2007，218103页)的原理可归纳为能够在两个最广义上的可区分的状态之间可逆地转换的任何类型的分子。通过光的影响来实现染料分子“转换”至两个可能的状态中的至少ー个。在这一点上，术语“转换”应被最广义地理解。RESOLFT显微术中，待检查的样本被特殊的分子标识，通常是荧光染料。有些使用染料分子中可光驱动区分的状态。特别地，染料分子在至少两个状态之间来回转换或上下转换。这些状态可以是给出信号的明亮状态和不给出信号的黑暗状态。借由光的作用来实现染料分子转换至两个状态中的至少ー个。术语“RESOLFT显微术”应被理解为通用术语，其包括了根据相似的原理工作的不同方法。例如，STED (受激发射损耗)显微术属于RESOLFT显微术。在这种方法中，荧光染料可在电子基态和激发态之间来回改变，并在这个过程中发出荧光。在黑暗状态中，染料通过受激发射永久地維持在基态。因此，根据荧光染料在给出信号状态中发出荧光、而在黑暗状态中不发射光，存在着荧光染料的两个配置。属于RESOLFT显微术的另一方法是GSD(基态损耗)显微术。这里，荧光染料用作标记。在明亮状态中，荧光染料可在基态和激发态之间来回改变，并在这个过程中发出荧光。对于黑暗状态，分子的基态減少。这意外着分子被激发至不发出荧光的长寿命状态。一旦分子处于长寿命黑暗状态，其基态不再可用，因而不能再被激发至发出荧光。返回至明亮状态是自发地发生的。SPEM (饱和图案激发显微术)和SSM (饱和结构化照明显微术)也代表了 RESOLFT显微木。在这些方法中，最初生成负像，随后重构数学图像。根据上文给出的解释，基态取代黑暗状态。第一激发态相应于明亮状态。在RESOLFT显微术的背景下还需要提及的另一方法是上变频显微术(參见 D.H.Kim 和 J.U.Kang:Upconversion microscopy for Dio1gica丄applications, Microscopy, Science, Technology, Applications and Education，571—582页)。STAQ显微术也被归纳在RESOLFT显微术内。需要注意的一点是，本专利技术一般地涉及RESOLFT显微术中用于照明和探測的方法和装置，无论使用何种特别的方法。重要的是，都使用RESOLFT的基本原理，这种原理的应用可涉及所有可能代表该基本原理的方法。为简化对本专利技术的教导的说明，使用STED显微术这一例子来描述涉及RESOLFT的一般性教导，STED显微术使用产生激发光和受激光(相应于转换光)的脉冲或连续光源。前述类型的相应装置描述在DE4416558C2中，特别地关于扫描共焦荧光显微术。在该装置中，为了增加横向分辨率，使用激发光束照射样本点，被激发光作用的荧光分子被转变至激发态。此外，使用合适波长的受激光束照明样本点，处于激发态的荧光分子可借由受激发射的过程返回至基态。该激发光束和受激光束(转换光束)被布置成使得它们的光强分布或照明图案至少部分地在目标区域彼此重叠。在重叠区域的荧光分子在被激发光束激发后即刻因受激发射而被转变至基态，因此仅探測位于激发光束照明图案中的荧光分子所发出的光，而不探測位于受激光束的照明图案中或两个照明图案的重叠区域中的荧光分子所发出的光。借由光学滤波器可将受激发射光和/或发射的受激光从扫描显微术的探測光路中滤除，因而，仅探测来自除去了两个照明图案的重叠区域的激发光束的照明图案区域的荧光。因此，产生荧光发射的目标区域減少了，这降低了衍射受限成像的限制，从而提高了分辨率。已从DE10313138B4中获知了 STED显微术中用于照明或探测对象的装置，其中主分束器采用的是基于受激光束的辐射功率本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在RESOLFT显微术中用于照明和探测的方法，其采用脉冲或连续的光源以产生激发光和转换光，其中，以脉冲的形式照射激发光（4）；且激发光（4）的脉冲长度超过150皮秒，优选地长至几百皮秒，甚至长达几纳秒。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J·佛林，
申请(专利权)人：徕卡显微系统复合显微镜有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE