一种金边弧叶龙舌兰离体培养及再生体系建立的方法技术

本发明专利技术涉及一种金边弧叶龙舌兰离体培养及再生体系建立的方法，包括以下步骤：（1）无菌苗培养：以珠芽苗茎尖为外植体，消毒后接种于丛芽诱导培养基上诱导无菌苗；（2）愈伤组织诱导：以无菌苗茎尖为外植体，纵切后接种在愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导；（3）愈伤组织继代培养：将诱导的愈伤组织转入继代培养基中进行愈伤组织继代培养；（4）不定芽诱导及植株再生：将继代培养获得的块状或球状愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导和植株再生；（5）继代培养和生根：将再生植株转入继代培养基中进行继代培养，成苗后生根；（6）再生植株移栽；本方法简单，为金边弧叶龙舌兰的离体快繁和遗传改良打下了良好的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种龙舌兰麻离体培养及植株再生体系建立的方法，特别涉及，属于组织培养育苗

技术介绍
金边弧叶龙舌兰麻为龙舌兰科龙舌兰属多年生草本植物，主要分布在热带、亚热带地区，叶长椭圆形，丛生，呈螺旋状排列于基部，叶缘有黄白色条纹，叶片坚挺美观，四季常青，是主要的园林观赏植物之一，有重要的观赏价值，常用于盆栽或庭院观赏。金边弧叶龙舌兰2-3年开一次花，开花后便整株死亡，因此多用珠芽繁殖。国内外对龙舌兰麻的组织培养和植株再生做了一定的探索。目前已成功建立了亚洲马盖麻(Acan tala Robx)、灰叶剑麻(A fourcroydes Lem)、普通剑麻(A si sal ana Perrine)、蓝剑麻(A tequilana Weber cultivar azul)> A. parrasana Berger、A. tequilana、A.eras si spina > A. duranguensi sA. vera-cruz Mill·、A. atrovirens、A.和普通剑麻、Η. 11648等体外再生体系并获得了完整的再生植株；目前有关金边弧叶龙舌兰麻离体培养与植株再生的研究还未见报道，因此，建立金边弧叶龙舌兰的离体培养和植株再生体系，不仅为快速繁殖提供有效途径，同时为龙舌兰麻诱变育种、单倍体育种以及基因工程育种打下良好的基础，为遗传改良提供有效途径。`
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种金边弧叶龙舌兰离体培养和植株再生的方法，为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案是 一种金边弧叶龙舌兰离体培养和植株再生的方法，包括如下步骤 (1)外植体表面消毒及无菌苗培养 以金边弧叶龙舌兰珠芽苗茎尖为材料，先将外层老叶剥离，流水冲洗后用O. 3%高锰酸钾溶液处理30min，在超净工作台上用75%酒精处理f 2 min,再用O. 1%氯化汞溶液处理15 30 min，最后用无菌水冲洗3-5次，晾干后纵切，接种于丛芽诱导培养基HS (硝酸钾2500mg/L，磷酸二氢铵300 mg/L，二水氯化钙200 mg/L，七水硫酸镁400 mg/L，一水硫酸锰10 mg/L,七水硫酸锌I mg/L,硼酸5 mg/L,碘化钾I mg/L, 二水钥酸钠O.1 mg/L,五水硫酸铜O. 2 mg/L,六水氯化钴O.1 mg/L,七水硫酸铁27. 8 mg/L,乙二胺四乙酸二钠37. 3 mg/L,盐酸硫胺素O. 5 mg/L,盐酸卩比B多醇O. 5 mg/L,烟酸O. 5 mg/L,肌醇100 mg/L,甘氨酸2 mg/L)上，HS基本培养基添加6-苄氨基腺嘌呤6-BA浓度为2. 0-5. O mg/L,培养基的pH值为5. 8，蔗糖浓度为30 g/ L，卡拉胶浓度为8 g/ L，培养条件为每天光照12 h，暗培养12 h，光照强度1500 lux，培养温度为26±2°C ； (2)愈伤组织的诱导 取步骤(I)培养的生长健壮的无菌苗茎尖纵切后连同嫩叶一起接种于愈伤组织诱导培养基中培养2-4周，剥离外层叶片后转入相同培养基上进行愈伤组织诱导培养，愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基，添加外源激素为6-苄氨基腺嘌呤6-BA和萘乙酸NAA ;6_苄氨基腺嘌呤6-BA的浓度为1. 0-3. O mg/L，萘乙酸NAA的浓度为O. 1-1. O mg/L ;培养基的pH值为5. 8，蔗糖浓度为30 g/ L，卡拉胶浓度为8 g/ L ;培养条件为黑暗24 h，温度26±2V ； (3)愈伤组织继代培养 取步骤(2)诱导的淡黄绿色愈伤组织接种在继代培养基中进行继代培养，继代培养基为MS基本培养基，添加外源激素为6-苄氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3 丁酸IBA ；其中 6-BA 的浓度为1. 0-5. O mg/L ；NAA 的浓度为 O. 01-1. O mg/L, IBA 的浓度为 O. 01-1. Omg/L;培养基的pH值为5. 8，蔗糖浓度为30 g/ L，卡拉胶浓度为8 g/ L ;继代培养条件为光照12 h，黑暗12 h，光照强度1000 lux，温度26±2 V ； (4)不定芽诱导 取步骤(3)继代培养的浅黄绿色愈伤组织切成黄豆大小后接种到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导，不定芽诱导培养基为HSl (硝酸钾2250 mg/L，磷酸二氢钾400 mg/L，硫酸铵150 mg/L，二水氯化钙400 mg/L，七水硫酸镁400 mg/L，一水硫酸锰10 mg/L，七水硫酸锌5 mg/L,硼酸5 mg/L,碘化钾I mg/L, 二水钥酸钠O.1 mg/L,五水硫酸铜O. 2 mg/L,六水氯化钴O.1 mg/L,七水硫酸铁27. 8 mg/L,乙二胺四乙酸二钠37. 3 mg/L,盐酸硫胺素O. 5mg/L,盐酸卩比B多醇O. 5 mg/L,烟酸O. 5 mg/L,肌醇100 mg/L,甘氨酸2 mg/L)基本培养基，添加外源激素为6-苄氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3 丁酸IBA ;其中6-BA的浓度为1. 0-5. O mg/L ；NAA 的浓度为 O. 01-1. O mg/L, IBA 的浓度为 O. 01-1. O mg/L，培养基的 pH 值为5. 8，蔗糖浓度为30 g/ L，卡拉胶浓度为8 g/ L ;光照12 h，黑暗12 h，光照强度为1000lux，温度 26±2°C ； (5)继代和生根培养 待步骤(4)得到的不定芽成苗后转接到继代培养基中进行继代培养，继代培养所用培养基为HS基本培养基(硝酸钾2500mg/L，磷酸二氢铵300 mg/L，二水氯化钙200 mg/L，七水硫酸镁400 mg/L,—水硫酸猛10 mg/L,七水硫酸锌I mg/L,硼酸5 mg/L,碘化钾I mg/L,二水钥酸钠O.1 mg/L，五水硫酸铜O. 2 mg/L，六水氯化钴O.1 mg/L，七水硫酸铁27. 8 mg/L,乙二胺四乙酸二钠37. 3 mg/L,盐酸硫胺素O. 5 mg/L,盐酸卩比B多醇O. 5 mg/L,烟酸O. 5 mg/L，肌醇100 mg/L，甘氨酸2 mg/L)。添加外源激素为6-苄氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和叼丨哚3 丁酸IBA ;其中6-BA的浓度为1. 0-5. O mg/L ；NAA的浓度为O. 01-1. O mg/L, IBA的浓度为O. 01-1. O mg/L，培养基的pH值为5. 8，蔗糖浓度为30 g/ L 1，卡拉胶浓度为8 g/L;光照12 h，黑暗12 h，光照强度为1500 lux，温度26±2°C ； 待继代培养的再生植株长到5-8 cm时转入生根培养基中进行生根培养，生根培养所用培养基为不加激素的MS基本培养基，培养基的pH值为5. 8，蔗糖浓度为30 g/ L，卡拉胶浓度为8 g/ L ;培养条件为光照12 h，黑暗12 h，光照强度为1500 lux，温度26±2°C。 (6)再生植株移栽 待再生植株生根4周，长出4-8条壮根时，将其置于自然条件下炼苗I周，然后将其移出，洗净基部残留的培养基，用3%高锰酸钾浸泡1-3 min后移植到基质为火烧土 椰糠河沙(2 1 1)的塑料遮光大棚中，大棚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金边弧叶龙舌兰离体培养及再生体系建立的方法，其特征在于：包括如下步骤:????(1)外植体表面消毒及无菌苗培养以金边弧叶龙舌兰珠芽苗为材料，将外层老叶剥离，流水冲洗，用0.3%高锰酸钾溶液处理20~40?min，然后在超净工作台上用75%酒精处理1~2?min，再用0.1%氯化汞溶液处理15~30?min，最后用无菌水冲洗3?5次，晾干后纵切，接种于HS基本培养基上诱导无菌苗；培养条件为光照12?h，暗培养12?h，光照强度为1500?2000?Lux，培养温度为26±2?℃；所述的HS基本培养基为：硝酸钾2500?mg/L，磷酸二氢铵300?mg/L，二水氯化钙200?mg/L，七水硫酸镁400?mg/L，一水硫酸锰10?mg/L，七水硫酸锌1?mg/L，硼酸5?mg/L，碘化钾1?mg/L，二水钼酸钠0.1?mg/L，五水硫酸铜0.2?mg/L，六水氯化钴0.1?mg/L，七水硫酸铁27.8?mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3?mg/L，盐酸硫胺素0.5?mg/L，盐酸吡哆醇0.5?mg/L，烟酸0.5?mg/L，肌醇100?mg/L，甘氨酸2?mg/L，?6?苄氨基腺嘌呤6?BA?2.0?5.0?mg/L，HS培养基的pH值为5.8，蔗糖浓度为30?g/L，卡拉胶浓度为8?g/L；????(2)愈伤组织的诱导????取步骤（1）培养的无菌苗茎尖，纵切后置于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导，愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基，添加外源激素为6?苄氨基腺嘌呤6?BA和萘乙酸NAA；其中6?苄氨基腺嘌呤6?BA的浓度为1.0?3.0?mg/L，萘乙酸NAA的浓度为0.1?1.0?mg/L；培养基的pH值为5.8，蔗糖浓度为30?g/?L，卡拉胶浓度为8?g/?L；培养条件为黑暗24?h，温度26±2?℃；?????(3)愈伤组织继代培养????将步骤（2）诱导的愈伤组织接种在愈伤组织继代培养基中进行继代培养，继代培养基为MS基本培养基，MS基本培养基添加外源激素为6?苄氨基腺嘌呤6?BA、萘乙酸NAA和吲哚3丁酸IBA；其中6?BA的浓度为1.0?5.0?mg/L；?NAA的浓度为0.01?1.0?mg/L，IBA的浓度为0.01?1.0?mg/L；培养基的pH值为5.8，蔗糖浓度为30?g/L，卡拉胶浓度为8?g/L；继代培养条件为：光照12?h，黑暗12?h，光照强度1000?lux，温度26±2?℃；??????(4)不定芽诱导将步骤(3)得到的浅黄绿色愈伤组织转接到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导，不定芽诱导培养基为HS1基本培养基，培养基添加外源激素为6?苄氨基腺嘌呤6?BA、萘乙酸NAA和吲哚3丁酸IBA；其中6?BA的浓度为1.0?5.0?mg/L；NAA的浓度为0.01?1.0?mg/L，IBA的浓度为0.01?1.0?mg/L，培养基的pH值为5.8，蔗糖浓度为30?g/l，卡拉胶浓度为8?g/?L；光照12h，黑暗12h，光照强度为1000?lux，温度26±2℃；所述的HS1基本培养基为：硝酸钾2250?mg/L，磷酸二氢钾400?mg/L，硫酸铵150?mg/L，二水氯化钙400?mg/L，七水硫酸镁400?mg/L，一水硫酸锰10?mg/L，七水硫酸锌5?mg/L，硼酸5?mg/L，碘化钾1?mg/L，二水钼酸钠0.1?mg/L，五水硫酸铜0.2?mg/L，六水氯化钴0.1?mg/L，七水硫酸铁27.8?mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3?mg/L，盐酸硫胺素0.5?mg/L，盐酸吡哆醇0.5?mg/L，烟酸0.5?mg/L，肌醇100?mg/L，甘氨酸2?mg/L；???（5）继代和生根培养????待步骤(4)得到的不定芽成苗后转接到继代培养基中进行继代培养，继代培养所用培养基为HS基本培养基，添加外源激素为6?苄氨基腺嘌呤6?BA、萘乙酸NAA和吲哚3丁酸IBA；其中6?BA的浓度为1.0?5.0?mg/L；NAA的浓度为0.01?1.0?mg/L，IBA的浓度为0.01?1.0?mg/L；待继代培养的再生植株长到5?8cm时转入生根培养基中进行生根培养，生根培养所用培养基为不加激素的MS基本培养基，培养基的pH值为5.8，蔗糖浓度为30?g/?L，卡拉胶浓度为8?g/?L；培养条件为：光照12h，黑暗12h，光照强度为1500?lux，温度26±2℃；所述的HS基本培养基为：硝酸钾2500mg/L，磷酸二氢铵300?mg/L，二水氯化钙200?mg/L，七水硫酸镁400?mg/L，一水硫酸锰...

【技术特征摘要】
1.一种金边弧叶龙舌兰离体培养及再生体系建立的方法，其特征在于包括如下步骤(1)外植体表面消毒及无菌苗培养以金边弧叶龙舌兰珠芽苗为材料，将外层老叶剥离，流水冲洗，用O. 3%高锰酸钾溶液处理2(T40 min，然后在超净工作台上用75%酒精处理广2 min，再用O. 1%氯化汞溶液处理 15^30 min，最后用无菌水冲洗3-5次，晾干后纵切，接种于HS基本培养基上诱导无菌苗；培养条件为光照12 h，暗培养12 h，光照强度为1500-2000 Lux，培养温度为26±2 °C ;所述的HS基本培养基为硝酸钾2500 mg/L，磷酸二氢铵300 mg/L，二水氯化钙200 mg/L，七水硫酸镁400 mg/L,—水硫酸猛10 mg/L,七水硫酸锌I mg/L,硼酸5 mg/L,碘化钾I mg/L, 二水钥酸钠O.1 mg/L,五水硫酸铜O. 2 mg/L,六水氯化钴O.1 mg/L,七水硫酸铁27. 8 mg/L, 乙二胺四乙酸二钠37. 3 mg/L,盐酸硫胺素O. 5 mg/L,盐酸卩比B多O. 5 mg/L,烟酸O. 5 mg/ LJiWflOO mg/L，甘氨酸2 mg/L, 6-苄氨基腺嘌呤6-BA 2. 0-5. O mg/L，HS培养基的pH值为5. 8，蔗糖浓度为30 g/L，卡拉胶浓度为8 g/L ；(2)愈伤组织的诱导取步骤(I)培养的无菌苗茎尖，纵切后置于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导， 愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基，添加外源激素为6-苄氨基腺嘌呤6-BA和萘乙酸 NAA ;其中6-苄氨基腺嘌呤6-BA的浓度为1. 0-3. O mg/L，萘乙酸NAA的浓度为O. 1-1. O mg/ L ;培养基的pH值为5. 8，蔗糖浓度为30 g/ L，卡拉胶浓度为8 g/ L ;培养条件为黑暗24 h，温度 26±2 V ；(3)愈伤组织继代培养将步骤(2)诱导的愈伤组织接种在愈伤组织继代培养基中进行继代培养，继代培养基为MS基本培养基，MS基本培养基添加外源激素为6-苄氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3 丁酸IBA ;其中6-BA的浓度为1. 0-5. O mg/L ； NAA的浓度为O. 01-1. O mg/L, IBA的浓度为O. 01-1. O mg/L ;培养基的pH值为5. 8，蔗糖浓度为30 g/L，卡拉胶浓度为8 g/L ;继代培养条件为光照12 h，黑暗12 h，光照强度1000 lux，温度26±2 V ；(4)不定芽诱导将步骤(3)得到的浅黄绿色愈伤组织转接到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导，不定芽诱导培养基为HSl基本培养基，培养基添加外源激素为6-苄氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸 NAA和吲哚3 丁酸IBA ;其中6-BA的浓度为1. 0-5. O mg/L ；NAA的浓度为O. 01-1. O mg/L, IBA的浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：张燕梅，周文钊，李俊峰，陆军迎，林映雪，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，
类型：发明
国别省市：