本发明专利技术涉及一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，将大蒜丛生芽或灭菌后的花苞等作为接种材料，转接到间歇浸没培养反应器中进行增殖诱导和鳞茎生成培养两个阶段，增殖培养结束后，在无菌条件下将增殖培养液替换为鳞茎生成培养液以促进大蒜小鳞茎形成，并进行移栽，以获得大量均一的大蒜种苗。本方法大大提高了大蒜种苗生产过程中的自动化程度，减少培养时的人力投入，并且可以大大提高增殖率。利用反应器生产大蒜种苗具有无病原菌，遗传均一稳定等优点，且成活率显著提高，劳动力成本显著降低。本方法在提高大蒜种苗质量的同时降低种苗成本，为低成本的生产大量高质量的大蒜鳞茎提供保障。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于植物细胞工程
具体涉及一种利用间歇浸没生物反应器进行大蒜组织培养和规模化快繁以快速获得大批量种苗(鳞茎)的方法。
技术介绍
XHPinellia spp.)是人们日常生活中不可或缺的调味品，一直以来深受广大人民群众的喜爱。且大蒜具有调节免疫力 ，保肝护肝，抗氧化，抗诱变以及抗癌等作用。传统的大蒜种植是以蒜瓣留种作为种植材料进行种植。此种方法具有两个方面明显的缺点。一是蒜瓣作为种植材料会消耗大量的大蒜产品，并且其繁殖率低，通常一个蒜瓣一个生长周期只能产生六到八个蒜瓣，致使种植成本居高不下；二是经过多代无性繁殖会使病毒等种传病害在繁殖体内积累，造成大蒜品质衰退，严重影响大蒜的产量和质量。通过研究，以上问题可以利用组培快繁的方法来解决。通过组培快繁利用优良大蒜品种作为扩繁的材料，可获得遗传基础和外观品质形状等重要性状均一的繁殖体，并且可以改变传统的以蒜瓣作为种植材料的现状，大幅度的降低种植的成本。同时组织培养过程中可以利用茎尖培养对侵染大蒜的病毒进行脱除，实现复壮的目的，使生产得到的大蒜种苗产量更高，品质更好。但是传统的组织培养方法得到的大蒜组培苗细弱，组培苗应用于大田生产时需要严格的驯化条件和管理操作。在进行炼苗移栽时，对组培苗上附着琼脂的清洗时对其伤害较大，因此炼苗成活率较低，且在生长一段时间后才能形成小鳞茎，不利于大蒜组培苗的生长。在国内关于大蒜的组织培养已经有很多方面的报道，如申请号为95116060. 5的“利用植物组织培养技术大规模生产无病毒种蒜的方法”、申请号为03111732. 5的“利用组织培养技术将大蒜再分化植物体的方法”及申请号为200910085914. 8的“大蒜胚性愈伤组织诱导的培养基”等。ZL200810101415. 2公开了一种快速繁殖大象大蒜(AlliumAmpeloprasun Var. mpeloprasun)的方法,采用不定芽增殖法快繁大象大蒜品种,利用顶端分生组织得到无菌苗，再利用无菌苗的基部得到的大量增殖不定芽；避免了组培过程中脱分化、再分化引起的组培苗玻璃化现象，极大地提高了繁殖系数。该方法包括外植体的消毒、无菌苗诱导、不定芽诱导和继代增殖、不定芽生根、组培苗移栽的操作步骤。以MS基本培养基为基础，添加不同比例的植物激素(A -萘乙酸NAA、吲哚丁酸IBA、6-苄基腺嘌呤6-BA、激动素KT、赤霉素GA)，通过不同的组合，在适宜的不定芽诱导和增殖培养基、生根培养基上快速繁殖出新植株。但是上述技术方案存在较大的缺点，主要体现在其过程中，需要反复转接繁殖体和更换固体培养基，导致操作复杂且耗费人工及物料等方面，并且培养时间长，从而致使生产得到的大蒜种苗成本居高不下而不易为广大种植户接受，因此难以真正推广应用
技术实现思路
利用传统固体培养基组织培养方法进行种苗生产的自动化水平低、且成本居高不下，其中很大的一部分是劳动力和能耗成本，如传统的大蒜种苗及微型鳞茎生产需要经历的初代诱导培养、继代增殖培养、生根培养及微型鳞茎诱导和后续的组培苗清洗和炼苗移栽都需要大量的人工，包括培养基的配制、大量培养瓶的清洗灌装灭菌和耗费劳动力最大的切割转接过程。这些都大大增加了组培生产过程中劳动力的投入。间歇浸没培养反应器主要是利用液体培养基对植物的组织器官进行间歇浸没培养，浸没时供给营养，间歇时提供足够的氧气。由于该培养方式较好的解决了液体培养时植物组织的玻璃化问题，并且营养物质随着对植物组织的浸没可以得到很好的传递，因此间歇浸没培养可以很好的解决植物组织培养中的各种难题。并且间歇浸没培养方式可以大大提高自动化水平和植物增殖效率，以及降低人力和物力的消耗。是替代传统培养的一种行之有效的方法。 利用间歇浸没培养反应器成功进行其它无性繁殖植物的组织培养的研究已有报道。如专利号为ZL 200910114406.1的“利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养快繁”的研究，其利用间歇浸没方式对三种甘蔗的培养进行了介绍，同时也为利用此种培养方式进行其它种类植物的培养提供了技术启示。但是间歇浸没培养方式用于植物的培养就如同植物组织培养方法对不同植物组织培养一样，一种培养方式应用于不同的植物时需要不同的条件及处理方式。培养时涉及到的培养方法如材料的选取、培养基构成、浸没频率、接种密度、培养时间、外界环境以及不同材料的处理方式等各个方面并不能通过简单的有限的实验推理来得到。专利中提及的五个步骤以及其中涉及到的具体的培养方式和培养条件完全不能用于大蒜种苗的培育，不仅所用的外殖体材料形态完全不同，且其操作的增殖培养、生根培养和生根苗驯化移栽的步骤也与大蒜的培养具有不同的培养思路。利用间歇浸没式培养方法进行大蒜组织培养快繁却未见报道和公开应用。本专利技术的目的在于提供一种规模化获得大蒜种苗的方法，具体是利用间歇浸没培养反应器进行大蒜组培快繁获得微型鳞茎，并进一步分级、炼苗和移栽后获得生产用大蒜种苗的方法。采用该方法相对于传统大蒜组织培养方法获得大蒜种苗具有以下特点1)增殖率高；2)种苗健壮；3)移栽成活率高；4)培养周期短；5)可提前下种；6)自动化程度高和节省劳动力消耗等优点。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是 基本步骤包括增殖培养、微型鳞茎生成培养、微型鳞茎分级及炼苗移栽，所述的增殖培养和微型鳞茎生成的步骤在同一个间歇浸没培养反应器中进行。具体地，所述的方法包括以下步骤 (1)增殖培养在无菌条件下将大蒜丛生芽或灭菌后的花苞接种到无菌的间歇浸没培养反应器中进行增殖培养； (2)微型鳞莖生成培养增殖培养结束后，在同一个间歇浸没培养反应器中，无菌条件下将增殖培养液替换为鳞茎生成培养液，进行继续培养后得到微型鳞茎； (3)微型鳞茎分级及炼苗移栽将得到的大蒜微型鳞茎分级，根据需要决定是否炼苗后移栽到栽培基质中。本专利技术所述方法包括如下具体步骤 (I)增殖培养无菌条件下将大蒜丛生芽或无菌处理后的花苞外植体接种到预先灭菌的间歇浸没培养反应器中进行增殖培养。其中，所述的间歇浸没培养反应器应理解为现有技术中任何间歇浸没式培养反应器，因为它们均具备对大蒜外植体进行间歇式浸没培养的功能。该步骤中间歇浸没培养参数为 浸没频率:1 20 min/3h,优选5 10min/3h ;接种密度:10 100个/L，优选30 80个/L ;培养时间15 30 d，优选2(T25d;增殖培养液配方可以但不限于Ms+1.(T5. 0 mg/L6-BA+O. 02 0. 2mg/L NAA+2. Omg/L KT+30 g/L 蔗糖；pH5. 0 6. 5，优选 5. 5 6. 0。培养条件为光照强度1500 2000 lux，光照8 18 h/d，优选10 15 h/d，温度25 ± I。。。其中，进一步优选间歇浸没培养反应器的参数设置为浸没频率8 min/3h ;接种密度60个/L ;培养时间22d ;增殖培养液配方为Ms+3. 0 mg/L 6-BA+O. lmg/L NM+2. Omg/L KT+30 g/L蔗糖，pH5. 8 ;培养条件为光照强度1800 lux，光照时间12 h/d，培养温度25。。。 (2)微型鳞莖生成培养增殖培养结束后，在同一间歇浸没培养反应器内，将组培苗的增殖培养液本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，包括增殖培养、微型鳞茎生成培养、微型鳞茎分级及炼苗移栽的步骤，其特征在于，所述的增殖培养和微型鳞茎生成的步骤均在同一个间歇浸没培养反应器中进行。
【技术特征摘要】
1.一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，包括增殖培养、微型鳞茎生成培养、微型鳞茎分级及炼苗移栽的步骤，其特征在于，所述的增殖培养和微型鳞茎生成的步骤均在同一个间歇浸没培养反应器中进行。2.根据权利要求1所述的一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，其特征在于，具体包括如下步骤(1)增殖培养在无菌条件下将大蒜丛生芽或灭菌后的花苞接种到无菌的间歇浸没培养反应器中进行增殖培养；(2)微型鳞莖生成培养增殖培养结束后，于同一间歇浸没培养反应器中，将增殖培养液替换为鳞茎生成培养液进行继续培养得到微型鳞茎；(3)微型鳞茎分级及炼苗移栽将得到的大蒜微型鳞茎分级，根据需要经炼苗后移栽到栽培基质中。3.根据权利要求2所述的一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，其特征在于，所述的步骤(I)间歇浸没培养反应器的参数设置为浸没频率广20 min/3h ； 接种密度1(Γ100个/L ;培养时间15 30 d ;增殖培养液配方为Ms+1. (Γ5. O mg/L 6-BA+O. 02 O. 2mg/L NAA+2. Omg/L KT+30 g/L 蔗糖，pH5. 0 6. 5 ;培养条件为光照强度 1500-2000 lux，光照时间 8 18 h/d，温度 25± 1°C。4.根据权利要求3所述的一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法， 其特征在于，所述的步骤(I)间歇浸没培养反应器的参数为浸没频率5 10 min/3h ； 接种密度30 80个/L ;培养时间2(T25d ;增殖培养液配方为Ms+1. (Γ5. O mg/L 6-BA+O. 02 O. 2mg/L NAA+2. Omg/L KT+30 g/L蔗糖，pH5. 5 6. 0 ;培养条件为光照强度 1500 2000 lux，光照时间10 15 h/d，温度25±1°C。5.根据权利要求4所述的一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，其特征在于，所述的步骤(I)间歇浸没培养反应器的参数设置为浸没频率8 min/3h ;接种密度60 个 /L ;培养时间22d ;增殖培养液配方...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈集双，贾明良，张本厚，王菁菁，丁爱军，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，南京工业大学大丰海洋产业研究院，
类型：发明
国别省市：
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