一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法，包括以下步骤：每年放流季节，海捕野生交尾雌虾，并进行眼柄标记，然后进行苗种培育。生产完成的雌虾-75℃超低温冰箱保存备用；秋季，在各放流洄游点进行放流个体的捕捞取样，样品回捕后通过两组中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术检测放流个体及数量，最终确定中国对虾的放流效果；本发明专利技术仅需对生产放流苗种的中国对虾母本进行样本采集，并利用两组荧光标记微卫星四重PCR对采集的放流样本进行亲子溯源分析，即可实现对放流中国对虾的跟踪识别。避免了现有技术需要大批量制备中国对虾全同胞家系、越冬中国对虾亲体培育、雄虾亲本识别的繁琐操作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于海水动物放流领域，具体地涉及一种简便易操作地可实现对放流中国对虾个体精确追溯的放流方法。
技术介绍
中国对奸(Fenneropenaeus chinensis)是我国特有的一年生大型经济奸类,主要分布在黄渤海沿岸海区，经济效益显著。二十世纪八十年代以来，由于捕捞强度的不断加大、生态变迁、水域污染、病害频发以及人工养殖业对野生中国对虾的盲目需求等综合因素的影响，中国对虾野生资源量急剧萎缩。为保护、恢复中国对虾种群和渔业资源，我国于 1984年开始在特定海区进行中国对虾移殖/增殖放流，每年放流约30亿尾仔虾。经过连续多年的大规模种苗放流，中国对虾资源量得到了一定的恢复。不过由于无法准确区分回捕群体中放流个体和野生个体及数量，因而无法科学评估放流群体对野生资源的补充水平， 分析野生资源的动态变化并制定科学的放流规划，这是中国对虾放流迫切需要解决的重大问题。衡量和评估放流效果的重要指标之一是放流回捕率估算，这是制定科学的放流规划、 有效促进野生中国对虾种群资源恢复的重要指标。但是现有的检测方法由于存在各种缺陷而无法提供精确的回捕率，主要存在以下几个原因1)回捕样品中无法准确区分放流和野生对虾个体；2)放流个体的物理标记过程操作繁琐、无法大规模进行，一般只对部分放流个体进行标记；3)物理标记对个体规格要求苛刻、标记后个体死亡率大，影响回捕率准确估算。因此，目前迫切需要一种技术对放流群体进行大批量标志，以此为中国对虾放流提供精确的回捕率数据。并且该技术应该具备以下特征1)放流个体携带特有的标识系统，该系统可精确区分野生和人工放流个体；2)携带该标识系统的个体可以大批量培育并维系个体一生，不会对标识个体具有任何内在或物理伤害；3)该标识个体可被迅速鉴别并与其它个体区分开来；4)标识个体放流不会破坏或影响野生中国对虾群体资源结构。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法，精确评估中国对虾放流效果，精确评估放流回捕率，推算野生群体资源量的目的，制定科学的放流规划、有效促进野生中国对虾种群资源恢复。本专利技术所采用的放流效果评估方法符合放流检测所要具备的5个条件1)具有确定遗传背景、不携带特定病原的中国对虾大规模多家系苗种培育；2)中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体/家系高效精确识别；3)携带特定DNA分子指纹图谱放流个体的标志放流；4)携带特定DNA分子指纹图谱放流个体的大规模检出；5)放流和野生资源及回捕率的精确计算。本专利技术是通过如下技术方案实现的一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法，包括以下步骤每年放流季节，海捕野生交尾雌虾，并眼柄标记，然后进行苗种培育，产卵后的雌虾-75°C超低温冰箱保存备用；秋季，在各放流洄游点进行放流个体的捕捞取样，样品回捕后通过两组中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术检测回捕样本，并确定放流个体的数量，最终评估中国对虾的放流效果； 其中所述的中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术，第一组微卫星四重 PCR引物组合及序列如下-6-FAM-CCTTGACACGGCATTGATTGG-3-VIC-TCAGTCCGTAGTTCATACTTGG-3-NED-CTCAACCCTCACCTCAGGAACA-3-PET-GCACATATAAGCACAAACGCTC-3反向序列为反向序列为反向序列为反向序列为EN0033正向序列为5 '5' -TACGTTGTGCAAACGCCA AGC-3'RS0622正向序列为5 '5' -CACATGCCTTTGTGTGAAAACG-3'FCKR002正向序列为5 5' -AATTGTGGAGGCGACTAAGTTC-3'FCKRO13正向序列为5 5' -CTCTCTCGCAATCTCTCCAACT-3'；进一步，所述的第一组四重PCR引物的反应体系为25μ I反应体系，其中包括 2. 5μ 110XPCR缓冲液、四种荧光标记引物的浓度均为10 μ Μ，ΕΝ0033正反引物每条各为 O. 25 μ 1，RS0622正反引物每条各为O. 5 μ 1，FCKR002正反引物每条各为O. 5 μ 1，FCKRO13 正反引物每条各为 O. 5μ1 ； IOOng 基因组 DNA、250ymol/LdNTPs 2. 5 μ 1,2. Ommo I/L Mg2+2. O μ I、I 单位 Taq DNA 聚合酶；进一步，所述的第一组四重PCR引物的PCR扩增程序为94°C变性4min后进行循环I :94°C变性40s，70°C退火Imin (每个循环退火温度降低1°C)，72°C延伸lmin，共循环5 次；随后进行循环2 :94°C变性40s，65°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循环8次；再进行循环3 :94°C变性40s,64°C退火Imin (每个循环退火温度降低1°C),72°C延伸lmin,共循环4 次；进行循环4 :94°C变性40s，61°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循环12次；最后72°C延伸 5min，4°C保存并结束程序。其中所述的中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术，第二组微卫星四重 PCR引物组合及序列如下RSllOl 正向序列为5 ‘-6-FAM—CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3 ‘，反向序列为5’ -TATTCCCACGCTCTTGTC-3 ‘FCKR005正向序列为 5’ -TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3FCKR007正向序列为 5， -CAACATAAGACTCACGAGACAG-3FCKR009正向序列为 5’ -ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-35(-Vic—CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3 ‘，反向序列为 (-NED—CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3 ‘，反向序列为 (-PET—GCACGAAAACACATTAGTAGGA-3 ‘，反向序列为进一步，所述的第二组四重PCR引物的反应体系为25μ I反应体系，其中包括2.5μ 110XPCR缓冲液、四种荧光标记引物的浓度均为10 μ Μ，ΕΝ0033正反引物每条各为 O. 25 μ 1，RS0622正反引物每条各为O. 5 μ 1，FCKR002正反引物每条各为O. 5 μ 1，FCKRO13 正反引物每条各为 O. 5μ1 ； IOOng 基因组 DNA、250ymol/LdNTPs 2. 5 μ 1,2. Ommo I/L Mg2+2. O μ I、I 单位 Taq DNA 聚合酶；进一步，所述的第二组四重PCR引物的PCR扩增程序为94°C变性4min后进行循环I :94°C变性40s，52°C退火lmin，72min延伸lmin，共循环10次；随后进行循环2 -MV 变性40 s，51°C退火Imin(每个循环退火温度降低O. 5°C)，72°C延伸Imin，共循环4次；再进行循环3 :94°C变性40 s，49°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循环10次；最后72°C延伸 5min，4°C保存并结束程序。进一步，放流效果的确定是按如下公式计算的放流回捕率=放流个体数量/样品总数。本专利技术进行个本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法，其特征在于包括以下步骤：每年放流季节，海捕野生交尾雌虾，并眼柄标记，然后进行苗种培育，生产完成的雌虾?75℃超低温冰箱保存备用；秋季，在各放流洄游点进行放流个体的捕捞取样，样品回捕后通过两组中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术检测放流个体及数量，最终确定中国对虾的放流效果；所述的两组中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术，第一组微卫星四重PCR引物组合及序列如下：EN0033正向序列为：5′?6?FAM?CCTTGACACGGCATTGATTGG?3′，反向序列为：5′?TACGTTGTGCAAACGCCA?AGC?3′；RS0622正向序列为：5′?VIC?TCAGTCCGTAGTTCATACTTGG?3′，反向序列为：5′?CACATGCCTTTGTGTGAAAACG?3′；FCKR002正向序列为：5′?NED?CTCAACCCTCACCTCAGGAACA?3′，反向序列为：5′?AATTGTGGAGGCGACTAAGTTC?3′；FCKR013正向序列为：5′?PET?GCACATATAAGCACAAACGCTC?3′，反向序列为：5′?CTCTCTCGCAATCTCTCCAACT?3′；所述的两组中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术，第二组微卫星四重PCR引物组合及序列如下：RS1101正向序列为：5′?6?FAM?CGAGTGGCAGCGAGTCCT?3′，反向序列为：5′?TATTCCCACGCTCTTGTC?3′FCKR005正向序列为:5′?VIC?CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT?3′，反向序列为：5′?TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT?3′FCKR007正向序列为:5′?NED?CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA?3′，反向序列为：5′?CAACATAAGACTCACGAGACAG?3′FCKR009正向序列为:5′?PET?GCACGAAAACACATTAGTAGGA?3′，反向序列为：5′?ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC?3′。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王伟继，张凯，孔杰，金显仕，阮晓红，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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