本发明专利技术公开了一种1,2,4-丁三醇的生物合成方法。该方法包括用重组生物细胞将苹果酸或其盐转化为1,2,4-丁三醇的步骤；所述重组生物细胞表达具有将苹果酸或其盐转化为1,2,4-丁三醇功能的酶系统。所述酶系统包括如下：（a1）具有将苹果酸或其盐转化为苹果酰辅酶A功能的酶；（a2）具有将所述苹果酰辅酶A转化为苹果酸半醛功能的酶；（a3）具有将所述苹果酸半醛转化为2,4-二羟基丁酸功能的酶；（a4）具有将所述2,4-二羟基丁酸转化为2,4-二羟基丁酰辅酶A功能的酶；（a5）具有将所述2,4-二羟基丁酰辅酶A转化为1,2,4-丁三醇功能的酶。本发明专利技术对建立拥有自主产权的、原料价格低廉的、合成途径全新的、转化效率较高的1,2,4-丁三醇的生物合成方法具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及种1,2,4-丁三醇的生物合成方法，特别涉及一种利用重组大肠杆菌将苹果酸及其盐形式转化为1,2,4-丁三醇的方法。
技术介绍
为了满足人类生产和生活方式不断进步的各种需求，越来越多的重要化学品受到了研究者的广泛关注。其中，1，2,4-丁三醇是一种在军工和民用上都具有重要用途的化学品。它是手性多羟基醇，主要用于合成高能材料1，2,4-丁三醇三硝酸酯，后者可用作飞机、火箭、导弹等军事武器的推进剂，较传统的硝化甘油具有冲击敏感性更低、热稳定性更好、挥发性更小和加工安全性更高四大优点，是硝化甘油理想、安全的替代品。硝化甘油目前在美国双基推进剂中的用量超过130万吨/年，若全部被1,2,4-丁三醇三硝酸酯替代，则1，2,4-丁三醇在美国军用方面的潜在市场需求量至少为170万吨/年，按照目前1,2,4-丁三醇12-19万元/吨的价格估算，其仅在美国军用市场上的市值就至少达2,000-3,000亿元/年。此外，1，2,4-丁三醇还可用于制备生物活性剂、医药用缓释剂、卷烟添加剂、抗菌剂、彩色显影剂等。 目前1，2,4-丁三醇主要以石油化工产品为原料，依靠化学法在高温高压下催化生产。其商业化的生产方式是，将苹果酸二甲酯在NaBH4和C2-C6醇的中进行还原反应，得率为0.48g/g。其存在的主要弊端有：原料成本高、反应能耗大、生产危险性大、副产物多、环境污染严重等。在当今各种全球问题的巨大压力下，人们更倾向于利用廉价的、可再生的生物质资源为原料，通过简单高效、对环境友好的生物发酵过程来生产1,2,4-丁三醇。但是，由于自然界不存在1,2,4-丁三醇的天然生物合成途径，所以生物法生产1,2,4-丁三醇的研究进展比较缓慢。迄今为止，仅一位美国学者在政府的大力支持下，先是利用木糖或阿拉伯糖原料，建立了1,2，4-丁三醇的生物合成途径（Niu,W.,Molefe,M.N.,Frost，J.W. Microbial synthesis ofthe energeticmaterial precursor1，2,4-butanetriol.Joumal ofthe American Chemical Society.2003,125(43):12998-12999.），之后经过不断优化，提高了木糖途径的1,2,4-丁三醇产量，达到35g/L木糖的生产水平（J·W·佛罗斯特，W·牛，D-1，2,4-丁三醇的微生物合成，中国专利申请号：200780032753.9，申请日：2007年7月19日；JohnW.Frost，GreenSyntheisofD-1，2，4ButantetroilfromD-Glucose.2009Annual Report，GrantNo.N000140710323）。继而再改造戊糖磷酸途径，以期利用葡萄糖而非木糖为原料，降低原料成本。截至目前，已通过两步法的生产方式，实现了以葡萄糖为原料的1,2,4-丁三醇的生物合成（John W. Frost，Green Syntheis ofD-1,2,4ButantetroilfromD-Glucose.2009Annual Report，GrantNo.N000140710323）：第一步，利用大肠杆菌WY9/pWY1实现了从葡萄糖到木质酸的生物转化，产量为5.5g/L木质酸；第二步，利用大肠杆菌DH5α/pWN6.186A实现了从木质酸到1，2,4-丁三醇的生物转化，转化率和产量均未报道。而将该两步合在起，将葡萄糖直接转化为1,2,4-丁三醇的一步法生产则未取得成功。究其原因，可能是由于葡萄糖本身在大肠杆菌的代谢网络中，进入戊糖磷酸途径的效率并不是很高所致。而葡萄糖经糖酵解进入TCA循环的效率则相对较高。 综上所述，如果能为将来建立一套拥有自主产权的、原料价格低廉的、合成途径全新的、转化效率较高的1，2，4-丁三醇的生物合成方法，将具有重要意义。目前尚未有以苹果酸或其盐类形式为原料生物合成1,2,4-丁三醇的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种1，2,4-丁三醇的生物合成方法。 本专利技术所提供的制备1,2,4-丁三醇的方法，包括用重组生物细胞将苹果酸或其盐转化为1,2,4-丁三醇的 步骤；所述重组生物细胞表达具有将苹果酸或其盐转化为1，2,4-丁三醇功能的酶系统。 在上述方法中，所述将苹果酸或其盐转化为1，2，4-丁三醇，具体包括如下步骤： （1）将苹果酸或其盐转化为苹果酰辅酶A；（2）将所述苹果酰辅酶A转化为苹果酸半醛；（3）将所述苹果酸半醛转化为2，4-二羟基丁酸；（4）将所述2，4-二羟基丁酸转化为2，4-二羟基丁酰辅酶A；（5）将所述2，4-二羟基丁酰辅酶A转化为2，4-二羟基丁醛；（6）将所述2,4-二羟基丁醛转化为1,2，4-丁三醇。 在上述方法中，所述酶系统具体包括如下（a1）-（a5）： （a1）具有将苹果酸或其盐转化为苹果酰辅酶A功能的酶1；（a2）具有将所述苹果酰辅酶A转化为苹果酸半醛功能的酶2；（a3）具有将所述苹果酸半醛转化为2，4-二羟基丁酸功能的酶3；（a4）具有将所述2,4-二羟基丁酸转化为2，4-二羟基丁酰辅酶A功能的酶4；（a5）具有将所述2，4-二羟基丁酰辅酶A转化为1,2,4-丁三醇功能的酶5。 具体的，所述酶1为琥珀酰辅酶A合成酶、苹果酸硫激酶中的至少一种；所述酶2为琥珀酸半醛脱氢酶；所述酶3为4-羟基丁酸脱氢酶；所述酶4为4-羟基丁酸辅酶A转移酶、肉桂酰辅酶A:苯乳酸辅酶A转移酶中的至少一种；所述酶5为双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶。 在本专利技术的一个实施例中，所述酶系统具体由如下酶1-酶5组成： 所述酶1为百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti）MAFF303099的琥珀酰辅酶A合成酶；所述琥珀酰辅酶A合成酶的β亚基的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述琥珀酰辅酶A合成酶的α亚基的氨基酸序列如序列表中序列2所示； 所述酶2为牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis）W83的琥珀酸半醛脱氢酶；所述琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示； 所述酶3为牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis）W83的4-羟基丁酸脱氢酶；；所述4-羟基丁酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示； 所述酶4为牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis）W83的4-羟基丁酸辅酶A转移酶；所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示； 所述酶5为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）DSM1731的双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶；所述双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示。 序列1由394个氨基酸组成；序列2由299个氨基酸组成；序列3由451个氨基酸组成；序列4由371个氨基酸组成；序列5由431个氨基酸组成；序列6由858个氨基酸组成。 在上述方法中，所述重组生物细胞是将如上所述酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备1,2,4？丁三醇的方法，包括用重组生物细胞将苹果酸或其盐转化为1,2,4？丁三醇的步骤；所述重组生物细胞表达具有将苹果酸或其盐转化为1,2,4？丁三醇功能的酶系统。
【技术特征摘要】
1.一种制备1,2,4-丁三醇的方法，包括用重组生物细胞将苹果酸或其盐转化为
1,2,4-丁三醇的步骤；所述重组生物细胞表达具有将苹果酸或其盐转化为1,2,4-丁三醇
功能的酶系统。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶系统包括如下（a1）-（a5）：
（a1）具有将苹果酸或其盐转化为苹果酰辅酶A功能的酶1；
（a2）具有将所述苹果酰辅酶A转化为苹果酸半醛功能的酶2；
（a3）具有将所述苹果酸半醛转化为2,4-二羟基丁酸功能的酶3；
（a4）具有将所述2,4-二羟基丁酸转化为2,4-二羟基丁酰辅酶A功能的酶4；
（a5）具有将所述2,4-二羟基丁酰辅酶A转化为1,2,4-丁三醇功能的酶5。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述酶1为琥珀酰辅酶A合成酶
和苹果酸硫激酶中的至少一种；
所述酶2为琥珀酸半醛脱氢酶；
所述酶3为4-羟基丁酸脱氢酶；
所述酶4为4-羟基丁酸辅酶A转移酶、肉桂酰辅酶A:苯乳酸辅酶A转移酶中的
至少一种；
所述酶5为双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述酶1为琥珀酰辅酶A合成酶，
所述琥珀酰辅酶A合成酶的β亚基的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述琥珀酰
辅酶A合成酶的α亚基的氨基酸序列如序列表中序列2所示；
所述酶2为琥珀酸半醛脱氢酶；所述琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列如序列表中
序列3所示；
所述酶3为4-羟基丁酸脱氢酶；所述4-羟基丁酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中
序列4所示；
所述酶4为4-羟基丁酸辅酶A转移酶；所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的氨基酸
序列如序列表中序列5所示；
所述酶5为双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶；所述双功能乙醛辅酶A/醇脱氢酶的氨基
酸序列如序列表中序列6所示。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述重组生物细胞是将如
下编码基因导入目的生物细胞后得到的表...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡真，李兴华，张延平，李寅，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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