多表位测定制造技术

本发明专利技术涉及一种在亲和力测定中检测生物学靶标的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含所述生物学靶标的生物学样品体积；将第一捕获部分加入包含所述生物学靶标的生物学样品体积，其中所述第一捕获部分粘附至颗粒；将捕获的生物学靶标浓缩为小于步骤a)中的生物学样品体积的洗脱体积；从所述颗粒切割所述第一捕获部分或所述生物学靶标以及以夹心或竞争性亲和力测定形式直接或间接检测和/或定量所述生物学靶标，其中所述生物学靶标与至少一种捕获部分相关，优选与至少两种捕获部分相关。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及亲和力测定的领域。具体地，本专利技术涉及一种在亲和力测定中检测生物学靶标的方法以及生物学靶标的检测配置。
技术介绍
亲和力测定是测量溶液中的物质，分析物的存在或浓度的生物化学测试，所述溶液通常包含物质的复杂混合物，例如生物学液体，如血液、唾液、血清或尿。这样的测定基于给定分子或所述分子的特定部分如抗体以高特异性结合至一种或非常有限组的其他分子的能力。测定的特异性取决于分析物能够结合至其特异性结合伙伴以排除待分析的样品中的所有其他物质的程度。除了需要特异性，必须选择对分析物具有足够高亲和力的结合伙伴以产生准确和可重复的测量，即可测量信号。在历史上，这通过测量一些物理特征如光散射的变化或折射率的变化来完成。通过现代仪器，这类方法再次越来越受欢迎。然而，现在的大多数免疫测定依赖于使用分析试剂以结合至分析物，所述分析试剂与可检测的标记相关。已证实各种标记，包括用于放射免疫测定的放射性元素；酶；荧光、磷光和化学发光染料；乳胶和磁性颗粒；染料微晶、金、银和硒胶体颗粒；金属螯合物；辅酶；电活性基团；寡核苷酸、稳定的自由基、聚合物等。这类标记用于分离游离和结合的标记试剂之后检测和定量结合事件，或者通过以结合事件影响标记产生的信号的变化这样的方式设计系统来检测和定量结合事件。亲和力测定通常探测肽、蛋白、寡核苷酸、寡糖或小分子如适配体与固定的结合伙伴的相互作用。典型的结合伙伴包括蛋白，其可以为受体、酶或抗体，但是还包括多肽和多氨基酸(例如，镍结合位点的多His标签、酰胺或Schiff碱连接的多赖氨酸、硫醚连接的多半胱氨酸)。例如，基于固定方案的链霉亲和素广泛用于将生物素化的生物学元素连接至测定表面。例如，亲和力测定可以进一步分类为竞争性和非竞争性测定。在竞争性亲和力测定中，生物学样品中的分析物与标记的分析物类似物竞争结合其伙伴。然后测量结合至伙伴的标记的分析物类似物的量。在这种方法中，反应信号与生物学样品中分析物的浓度成反比。这是因为反应信号越大，样品中越少分析物可用于与标记的分析物类似物竞争。在非竞争性亲和力测定中，其也称为“夹心测定”，生物学样品中的分析物结合至其伙伴，然后标记试剂结合至所述分析物。然后测量位点上标记试剂的量。不像竞争性方法，非竞争性方法即夹心测定的结果直接与生物学样品中分析物的浓度成比例。这是因为如果生物学样品中不存在分析物，则标记试剂不会结合。亲和力测定，特别是免疫测定广泛用作细菌、病毒、内分泌和寄生疾病的诊断工具以及滥用和慢性疾病状态的检测药物，一个实例是可以导致心脏病发作的心脏疾病。各种技术如放射免疫测定、免疫过氧化物酶和ELISA目前用于亲和力测定，特别是免疫测定。然而，放射免疫测定具有需要使用危险和破坏环境的试剂的缺点。此外，除了特异性，如上文所述，灵敏度对于测定性能是至关重要的。测定的灵敏CN 102947703 A书明说2/15 页度可以通过结合事件产生的特异性信号与系统的背景噪声相比的比例来定义。降低信噪比(SNR)的因素包括试剂如抗体非特异性结合至测定的各种组分。此外，与测定的试剂如酶底物反应的测定基质的一些内源性组分的活性倾向于产生“假”反应产物，其干扰标记的复合物如标记的抗体_抗原复合物形成的“真正”产物的准确检测。通常，将添加剂如封闭试剂加入测定基质以降低测定噪声并减少假阳性信号。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种与现有技术已知的亲和力测定相比具有更高信噪比的亲和力测定。本专利技术的另一目的是提供这样的亲和力测定，其适合广泛的分析物。具体地，本专利技术的目的是提供一种适合整合入医疗点或者台面、装置和微型化的亲和力测定。本专利技术的另一目的是提供一种产生最少假阳性结果的快速和可靠的亲和力测定。这些目的通过用独立权利要求所示的亲和力测定检测生物学样品中的生物学靶标的方法来实现。从属权利要求表明优选的实施方案。在这种上下文中值得注意的是，以下描述中给出的所有范围应当理解为它们包括限定这些范围的值。·附图说明本专利技术的这些和其他方面参考下文所述的实施方案会清楚和阐明。图I图示根据本专利技术将捕获的生物学靶标浓缩为小于生物学样品体积的洗脱体积以及检测和/或定量的进一步任选存在的步骤的一个实例。图2图示根据本专利技术在亲和力测定中检测生物学靶标的方法的一个实例。图3示出本专利技术怎样实现增加信噪比的目的的另一方面。图4示出第一捕获部分的组织的实例。图5示出合适的接头的模块设计的一些实例。图6示出富集的3-表位亲和力测定的概念验证。图7示出来自建立心肌肌钙蛋白-I (cTnl)和前列腺特异性抗原(PSA)的3_表位亲和力测定的初步实验的结果。图8图示热切割然后竞争性亲和力测定的实例。图9更详细地示出3-表位测定中的第一捕获部分不干扰检测。图10示出捕获时间常数的确定。图11示出步骤c)的评价，即对各种体积浓缩因素的生物学靶标浓缩的评价。图12示出步骤c)的剂量反应曲线，即生物学靶标浓缩的剂量反应曲线。具体实施方式根据本专利技术，通过亲和力测定检测生物学样品中的生物学靶标的方法包括以下步骤a)提供包含所述生物学靶标的生物学样品体积；b)将第一捕获部分加入包含所述生物学靶标的生物学样品体积，其中所述第一捕5获部分粘附至颗粒；c)将捕获的生物学靶标浓缩为小于步骤a)中的生物学样品体积的洗脱体积；d)从所述颗粒切割所述第一捕获部分或所述生物学靶标；e)以夹心或竞争性亲和力测定形式直接或间接检测和/或定量所述生物学靶标， 其中所述生物学靶标与至少一种捕获部分相关，优选与至少两种捕获部分相关。这种亲和力测定具有这样的优势，将生物学靶标浓缩并去除可以干扰检测的因素，因此导致增加的特异性结合和减少的非特异性结合，从而导致测定的大大增加的信噪比和更高的灵敏度。具体地，生物学靶标结合至第一捕获部分与生物学靶标的检测和/或定量分开是有益的。因此第一捕获部分的量与粘附的颗粒可以是大的，以便捕获尽可能多的生物学靶标，但是第一捕获部分与粘附的颗粒不干扰生物学靶标的检测和/或定量。例如，如果第一捕获部分与粘附至它们的大磁性颗粒用来捕获大体积的生物学靶标，例如生物学样品，其比较小的颗粒更易于驱动。因此，更易于从大体积(生物学样品)收集这些较 大的颗粒，并且将它们和结合的生物学靶标转移至较小的体积(洗脱体积)。如本文所用，术语“生物学靶标”指待检测的生物学来源的物质。生物学靶标的非限制性实例为蛋白、肽、抗体、毒性物质、脂质、氨基酸、胺、信使或小分子、碳水化合物、细胞组分、病毒、细胞外基质的组分、细胞、细胞片段、核酸、半抗原和/或药物。如本文所用，术语“亲和力测定”指测量生物学靶标的存在或浓度的生物化学测试，其基于捕获部分以高特异性结合至生物学靶标以及任选地结合至一种或非常有限组的其他分子的能力。如本文所用，术语“生物学样品体积”指其中最初提供生物学靶标的体积或部分体积。如本文所用，术语“捕获部分”指结合元件，例如这样的部分，其包含选择性结合至生物学靶标的表位的互补性决定区域并可以结合至至少一种其他实体如颗粒，并且可以具有与其相关的试剂。在一优选实施方案中，捕获部分为抗体，例如动物抗体、人抗体、人嵌合抗体和人源化抗体及其片段，如Fab片段等，或者为适配体，或者为核酸或多肽或包含结合位点的任何物质。如本文所用，术语“结合元件”指另一元本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.17 EP 10166390.4;2010.11.25 EP 10192505.51.一种在亲和力测定中检测生物学靶标的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包含所述生物学靶标的生物学样品体积；b)将第一捕获部分加入包含所述生物学靶标的生物学样品体积，其中所述第一捕获部分粘附至颗粒；c)将捕获的生物学靶标浓缩为小于步骤a)中的生物学样品体积的洗脱体积；d)从所述颗粒切割所述第一捕获部分或所述生物学靶标；e)以夹心或竞争性亲和力测定形式直接或间接检测和/或定量所述生物学靶标，其中所述生物学靶标与至少一种捕获部分相关，优选与至少两种捕获部分相关。2.如权利要求I所述的方法，其中在步骤e)中，所述第一捕获部分或第二捕获部分与另一捕获部分相关。3.如权利要求I或2所述的方法，其中在步骤e)中，所述生物学靶标与进一步的捕获部分相关。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤e)中，试剂与至少一种捕获部分相关，或者在竞争性亲和力测定形式的情况下，与所述生物学靶标的类似物相关。5.如权利要求4所述的方法，其中所述试剂选自放射性同位素；和/或固相，例如磁珠或乳胶珠或检测表面；和/或荧光、磷光和/或化学发光染料；和/或酶和/或酶底物；和/或核酸序列、肽；和/或胶体或纳米颗粒；和/或聚合物或大分子，例如树状聚体或脂质体。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述捕获的生物学靶标浓缩为小于步骤a)中的生物学样品体积的洗脱体积通过磁性分离或重力来进行。7.如前述权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·萨瓦特，M·W·J·普林斯，T·H·埃弗斯，W·M·哈德曼，J·G·奥塞尔，
申请(专利权)人：皇家飞利浦电子股份有限公司，
类型：
国别省市：