用于组织保存的产品和方法技术

本申请涉及用于提高福尔马林固定的、任选地石蜡包埋的生物材料的稳定性的方法。在一个实例中，在固定时或之前不久，将DNA酶抑制剂和/或RNA酶抑制剂与生物材料或福尔马林合并。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】交叉引用本申请要求于2010年4月12日提交的美国临时申请号61/323，185的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。
本专利技术总体上涉及例如在用于病理学分析或用于组织研究应用的组织处理过程中稳定大分子或保持组织完整性。本专利技术提供了一组用于组织保存的小分子或溶质。
技术介绍
甲醛水溶液(福尔马林)组织固定是目前医学病理学的黄金标准。在20世纪早期，福尔马林固定技术经高度优化得以支持染料和金属染色剂的使用。20世纪中期，由于大部分蛋白质表位稳定并且尺寸小，发现同样的福尔马林固定技术支持抗体在免疫组织化学中的应用。病理学中的固体组织固定(FFPE)标准是10%的磷酸盐缓冲的福尔马林，在25°C 下温育8-24小时，然后在乙醇中脱水，将溶剂更换成二甲苯，然后用熔化温度(Tm)约为 56°C的石蜡聚合物共混物包埋。该过程提供高度可重现的染料染色，但产生已断裂的并且被化学损伤内部修饰的DNA和RNA互补物。在完全脱水、石蜡包埋的组织中，DNA和RNA在长储存期内并不稳定。数据让人想起所有核酸在环境温度下在诸如滤纸的基质中干燥储存时所见的情况。这种时间依赖性的核酸损伤可能是由于残余水污染所造成的(缓慢)水解，或者甚至更可能地，是由于核酸与已经渗透进FFPE组织块的分子氧的扩散相互作用所造成的核酸碱基(尤其是G)的缓慢氧化。在甲醛水溶液处理过程中导致的并发核酸损伤，由于核酸的不稳定性和基因组测试所需要的大片段核酸靶标-通常至少500个碱基，极大地限制了基因组学的应用。已经证明，如果通过使用有机溶剂混合物来完全取代福尔马林进行固定，能够获得高度稳定的DNA 和RNA。然而，这些“非福尔马林”方法尚未被病理学界接受，因为它们产生的组织形态学变化虽然少但非常显著，并且基于溶剂的固定剂需要对一个世纪以来的实验室标准操作程序进行显著的改变。
技术实现思路
本专利技术提供在样品固定过程中使用降解抑制剂来增加/维持样品内容物(例如， 样品核酸、蛋白质等)的完整性。例如，在一个实施方式中，此处所述的组合物、方法和试剂盒可用于抑制蛋白质的翻译后磷酸化修饰(即磷_蛋白质)的完整性的损失。在另一个实施方式中，此处所述的组合物、方法和试剂盒可用于抑制以下材料的降解或维持其完整性 纯化或未纯化的多核苷酸，包括例如DNA (dsDNA和ssDNA)、甲基化DNA、线粒体DNA、叶绿体 DNA、DNA-RNA杂合体、RNA、mRNA、rRNA或其混合物，例如微生物如细菌、酵母、病毒、类病毒、霉菌、真菌、植物、动物、人类的生物材料的基因、染色体、质粒和基因组及其片段。因此，降解抑制剂可以是多核苷酸降解抑制剂或蛋白质降解抑制剂。可以进一步分析此处所述的样品以用于体外诊断应用或研究应用。在一些实例中，采用核酸分析法分析此处所述的样品。可以在根据本专利技术的方法固定后对样品核酸进行的核酸分析的例子包括但不限于扩增，如单链扩增、指数式扩增、PCR、数字PCR、定量PCR、实时PCR，测序，包括焦磷酸测序、单链延伸测序、单分子测序、连接测序、杂交测序，RFLP, SNP分析,微阵列分析等。可以进一步分析此处固定的样品以检测或诊断病症，包括但不限于癌症、胎儿异常、自身免疫病和其他遗传性疾病。核酸降解抑制剂的例子包括，例如核酸酶抑制剂。优选地，本专利技术使用的核酸降解抑制剂是具有透过细胞或组织的能力的小分子。与不存在抑制剂的条件下的降解相比，核酸降解抑制剂优选地抑制多核苷酸降解达至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或 99.5%。所用的抑制剂的浓度可以变化。在一些实例中，可以加入此处所述的抑制剂以达到< O. 05、O. lmM、0. 5mM、或IOmM的单独或最终集合浓度。在一些实例中，核酸降解抑制剂是DNA酶抑制剂或RNA酶抑制剂。在一些实例中，在“固定”过程中将多种组织渗透性的、广谱核酸酶抑制剂加入固定剂(如福尔马林)中。固定步骤中广谱核酸酶抑制剂的加入导致更好的DNA和/或RNA 完整性。例如，采用本专利技术的方法，DNA可以保持大于约I. 0,5. O或IOkb的长度超过一周、 一个月、一年或十年。同样地，采用本专利技术的方法，RNA可以保持大于约O. 1、0.5、1.0或IOkb 的长度超过一周、一个月、一年或十年。表I在此描述了示例性的核酸酶抑制剂。表2描述了示例性的ROS清除剂。在一些实施方式中，降解抑制剂是磷酰基转移酶超家族的抑制剂。在一些实施方式中，降解抑制剂是小分子。然而，它也可以是酶或抗体或其他化合物。优选地，抑制剂具有高组织渗透性。例如，本专利技术的抑制剂可以以> lmm/hr、5mm/hr、 10mm/hr>20mm/hr> 100mm/hr的速率渗透组织。在一些实例中，本专利技术的降解抑制剂以50% 的抑制剂在4小时、3小时、2小时、I小时、30分钟、20分钟、10分钟或I分钟内渗透组织的速率渗透组织。在一些实例中，降解抑制剂包含螯合剂。螯合剂可以是Mg2+螯合剂，或更优选 EDTA。在一些方面，螯合剂与RNA酶抑制剂或DNA酶抑制剂联合使用。优选地，降解抑制剂小到足以容易地扩散到直径小于40nm的孔内。降解抑制剂可以单独使用或联合使用。在一些实例中，在固定步骤中至少加入2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的核酸降解抑制剂，例如通过加入到固定剂中或乙醇的醇清洗液中。例如，核酸酶抑制剂、ROS清除剂和/或磷酰基转移酶超家族抑制剂的组合可以一起加入。如上面所提供的，抑制剂可以加入到固定剂中。或者备选地或额外地，它们也可以加入到醇清洗液(例如，在组织处理过程中使用的第一水_乙醇清洗液)中。因此，在一些实例中，本专利技术涉及含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种不同的降解抑制剂的组合物，这些降解抑制剂或者都在一个容器中或者在不同的容器中但在一个试剂盒中。在一些实例中，本专利技术涉及含有固定剂(如福尔马林)的容器和在同一溶液或容器中或者在不同溶液或容器中但在同一试剂盒中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种不同的降解抑制剂。在又一实施方式中，本专利技术涉及含有醇清洗液(如乙醇清洗液)的容器和在同一溶液或容器中或者在不同溶液或容器中但在同一试剂盒中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 种不同的降解抑制剂。因此，在一个实施方式中，本专利技术涉及含有福尔马林和降解抑制剂的溶液。优选地，降解抑制剂是分离的或合成的。优选地，降解抑制剂是小分子。溶液可以进一步含有样品。在一些实施方式中，溶液由或基本由福尔马林或其他固定剂和降解抑制剂组成。降解抑制剂优选地在37°C下一个月后在福尔马林固定的组织中以下述水平保持不受损伤的DNA链长度和不受损伤的RNA链长度，其与完成固定后立即获得的水平相当或与该水平相差在 90%,80%,70%,60%,50%,40%,30%,20%,10%,5%,3%^； 1% 内。可在福尔马林固定过程之前或期间加入核酸降解抑制剂。因此，本专利技术提供包含以下成分、由以下成分组成或基本由以下成分组成的组合物(i) 一种或多种降解抑制剂，和(ii)福尔马林或醇清洗液。在本专利技术的任何实施方式中，福尔马林可以是磷酸盐缓冲的1-37质量％的福尔马林。本专利技术的任何组合物可进一步含有生物样品。该生物样品优本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·霍甘，
申请(专利权)人：金沃特公司，
类型：
国别省市：