一种聚合物基材表面固定化酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种聚合物基材表面固定化酶的方法，属于固定化酶制备技术领域。本发明专利技术分为以下步骤：第一步、在聚合物表面吸附光引发剂或共价连接光感应休眠基团；第二步、在可见光或紫外光照射下，光引发剂或休眠基团产生自由基，引发含有游离酶的单体溶液进行可控交联聚合反应，最终将酶固定在表面交联网络中。酶的固定化在可见光、低温或室温下进行，反应条件温和，有利于酶活性的保持。凝胶/基材复合结构提高了交联网络的机械强度，克服了凝胶网络易被破坏的缺点，不仅提高了酶的稳定性，也实现了酶的回收再利用。该方法既适用于单酶固定，也适用于复酶固定。

【技术实现步骤摘要】
CN 102925425 A书明说1/6页
本专利技术属于固定化酶制备
，具体涉及可见光引发的聚合物基材表面固定化酶方法。
技术介绍
利用酶为催化剂的化学反应具有催化效率高、底物选择性高、反应条件温和等优点，是实现绿色化学、可持续发展的重要技术手段之一。但是，游离酶也存在易变性的缺点， 在高温、强酸、强碱、紫外线等环境下易失去催化活性，并且在反应后不易分离，不仅污染产物，也因不能重复利用而使成本提高，不利于其实际应用。为了解决这一难题，可以对游离酶进行固定化。酶的固定化使酶易于与产物分离，能够回收以重复利用，并可提高酶的稳定，因此能较好满足工业应用需求。目前常用的固定酶方法主要有共价键合法，物理吸附法，交联法和包埋法。包埋法与物理吸附法相比对酶具有更强的结合力，与共价键合法和交联法相比固定条件更加温和，适用于酶的范围更广，在酶固定技术中具有独特的优势。近年来，以聚合物凝胶为载体的酶固定技术成为热点，并被用于生物催化、生化检测等诸多领域。但是，聚合物凝胶普遍存在机械强度较低的缺点，在实际应用中很容易被破坏而丧失其功能。因此，将凝胶接枝在机械强度较高的基材上，制备具有支撑基质的凝胶膜成为一种新型的制备高性能凝胶材料的方法。接枝凝胶膜具有与表面接枝聚合物刷相似的特点，并且与后者相比，前者具有更多的优势。首先，表面三维网络结构可以通过更多的连结点与基材键接，而接枝聚合物刷每条链只有一个与基材相连的共价键，因此表面三维网络更加稳定。 其次，凝胶膜能够对基材表面进行改性，以较少的接枝位点达到聚合物刷密接枝才能产生的改性效果，对基材的覆盖更加均匀。目前有多种方法制备以聚合物为基材的凝胶复合膜。Rubira等用铬酸氧化法在低密度聚乙烯表面引入了羧基，又通过羧基与乙二胺反应引入了氨基，再进一步使氨基与聚丙烯酸的羧基发生缩合反应最终形成了凝胶膜，通过控制反应条件可以制备出纳米到微米厚的凝胶膜(Applied Surface Science, 2009, 255, 6345-6354)。Harmon 等 (Macromolecules, 2002, 35,5999-6004)和 Varvarenko 等(Reactive & Functional Polymers, 2010, 70 647-655)借鉴合成表面聚合物刷所用到的“graft from”方法,提出了类似的接枝凝胶膜的方法即先将引发剂固定在基材表面，再在适当条件(紫外光辐照、 加热等)下引发表面的单体和交联剂溶液聚合，形成凝胶薄膜。虽然上述方法得到的复合膜具有凝胶(载体)和基材(机械强度高)的双重优点，但是却并不适于酶的包埋，主要是由于上述反应条件苛刻，所用到的高温、高能量的紫外光会导致酶变性而失活。基于光聚合的基本原理，杨万泰发现，在聚合物表面引入休眠基，在可见光照射下可以引发乙烯基单体可控接枝聚合，从而在表面引入聚合物接枝链。但是，相关的专利(杨万泰等，CN101307122A)和论文(Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 47, 6852,2009)并没有涉及可见光引发交联聚合制备凝胶/基材复合膜用于酶固定的内容。因此，有必要设计出一种简单、条件温和的方法制备凝胶/基材复合膜，以实现对3游离酶的有效包埋。
技术实现思路
为克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的是提供一种可见光引发的聚合物基材表面接枝凝胶层原位固定游离酶的方法。该方法操作简单，条件温和，能够在制备凝胶/基材复合膜的同时实现对游离酶的有效包埋。为了达到上述目的，本专利技术按照以下技术方案实现(I)用光引发剂的溶液浸溃或涂覆在聚合物基材表面或将光引发剂的溶液夹在聚合物材料之间形成“三明治”型结构，使聚合物基材吸附光引发剂或对覆盖光引发剂溶液的聚合物表面进行紫外光照射引入半频哪醇休眠基。(2)在可见光照射下，光引发剂或休眠基团产生自由基，引发含有游离酶的可聚合溶液进行可控交联聚合反应，最终将酶固定在表面交联网络中。所述光弓I发剂为硫杂蒽酮、氧杂蒽酮或两者的衍生物。所述的聚合物基材为聚合物链含有碳一氢键的能够进行光引发剂夺氢反应的有机材料。包括低密度聚乙烯LDPE、高密度聚乙烯HDPE、流延聚丙烯CPP、双向拉伸聚丙烯 Β0ΡΡ、聚对苯二甲酸乙二醇酯PET、聚对苯二甲酸丁二醇酯PBT、聚酰胺PAM、聚氯乙烯PVC、 聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚马来酸酐PMA、聚碳酸酯PC、聚己内酯PCL、纤维素、纤维素酯、酚醛树脂或环氧树脂。所述的聚合物选自聚合物片材、多孔膜，纺织品和非织造织物。所用可见光或紫外光的设备，为低压、中压、高压汞灯，碘钨灯或氙灯。所述含有游离酶的可聚合溶液组成如下单烯类单体质量百分含量为0%_10%，交联剂质量百分含量为10%-90%，酶质量百分含量为O. 05%-5%，余量为溶剂。游离酶可以是单酶，也可以是复酶。所述单体包括丙烯酸AA，甲基丙烯酸MAA，丙烯酰胺AM，甲基丙烯酸缩水甘油酯 GMA,甲基丙烯酸羟乙酯HEMA，乙烯基吡啶VP或乙烯基吡咯烷酮NVP ;交联剂包括聚乙二醇双丙烯酸酯PEGDA，聚乙二醇双甲基丙烯酸酯PEGDMA，亚甲基双丙烯酰胺MDA，二乙二醇二丙烯酸酯DEGDA，二乙二醇二甲丙烯酸酯DEGDMA或三羟甲基丙烷三丙烯酸酯TMPTA。可见光照射下具体条件为(波长420nm处光强为1600-5000 μ ff/cm2),照射1-2小时后取样。本专利技术的优点在于1)酶的固定化在低温/室温、可见光下进行，反应条件温和， 有利于酶活性的保持。2)接枝交联聚合呈可控/活性特征，能够得到网孔大小均匀和可调的交联结构。并且凝胶网络具有三维结构，可以通过增大厚度提高酶的包埋量。3)凝胶/ 基材复合结构提高了交联网络的机械强度，克服了凝胶网络易被破坏的缺点，不仅提高了酶的稳定性，也实现了酶的回收再利用。以下结合实例详述本专利技术。具体实施方式实施例I :将LDPE膜用丙酮(抽提及洗涤溶液)抽提72小时，室温晾干。将BOPP膜覆盖于LDPE膜上方，取50 μ L异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液(浓度为O. 5Μ)注入双层聚合物之间， 然后用两片石英片将双层聚合物压实，异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯辐照装置(波长254nm处光强为9000 μ ff/cm2)中室温下照射180秒。将已引入能够继续引发自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提I小时，去除表面吸附的异丙基硫杂蒽酮，在室温下晾干。将聚乙二醇双丙烯酸酯(分子量575)和葡萄糖酶共同溶于PH = 7. O的磷酸盐缓冲溶液中，其中聚乙二醇双丙烯酸酯的质量百分含量为 20%，葡萄糖酶的质量百分含量为O. 1%。取20 μ L的上述含酶溶液注入BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，移入氙灯辐照装置(波长420nm处光强为2000 μ ff/cm2)室温下照射I小时后取样。将得到的载酶复合膜用去离子水冲洗表面后冷冻干燥，4°C冰箱中保存。采用滴定法测量酶活，取面积为4X4cm2的载葡萄糖氧化酶复合膜(或游离酶)于锥形瓶中，加入25mL 2%葡萄糖磷酸缓冲液(pH 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种聚合物基材表面固定化酶的方法，特征在于包括以下步骤：第一步，聚合物表面吸附光引发剂或通过紫外光照射共价连接光感应休眠基团，所述聚合物为聚合物链含有碳－氢键的能够进行光引发剂夺氢反应的有机材料；第二步：在可见光照射下，光引发剂或休眠基团产生自由基，引发含有游离酶的可聚合溶液进行可控交联聚合反应，最终将酶固定在表面交联网络中。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨万泰，赵长稳，马育红，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：