鉴别纯冬虫夏草粉的方法技术

本发明专利技术属于药材鉴别领域，具体涉及一种显微染色鉴别纯冬虫夏草粉的方法。本发明专利技术要解决的是市场流通与销售的纯冬虫夏草粉难于分真伪的技术问题。本发明专利技术解决该问题的技术方案是提供一种准确鉴别冬虫夏草粉的方法。该方法包括以下步骤：取待检冬虫夏草粉，染色制成涂片；将制成的涂片于显微镜下进行显微观测，如每片均能清晰观察到冬虫夏草的特有结构，且没有碘液染色下的明显蓝色斑点，并且没有观测到明显的植物组织，即可判断为纯冬虫夏草粉，否则为不纯的冬虫夏草粉。本发明专利技术方法能清晰辨认细小的饮片粉末和分辨出不属于冬虫夏草的物质，成本低、效率高，不易受各种添加成分的干扰，准确度非常高，在本领域有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药材鉴别领域，具体涉及一种显微染色鉴别冬虫夏草粉的方法。
技术介绍
在我国传统的医药中，冬虫夏草一直就是高级滋补品，药用地位十分显著，与人参、鹿茸并称为“三大补品”。随着各相关学科领域的深入研究，近年来不断有虫草新的种类、新的分布的报道，化学成分不断被分离、鉴定，而有关免疫、抗肿瘤等多方面的药理、药 效学研究充分证实了冬虫夏草的药效。由于冬虫夏草的特殊生长环境、特殊的地理环境及重要的经济价值，使得人们的研究兴趣倍加强烈，尤其是对冬虫夏草及其代用品的研究更是十分活跃。目前市场流通与销售的纯冬虫夏草粉，由于被制成了一定的剂型，很难区分真伪，虽然可以用检验仪器的手段，证明冬虫夏草的若干标记物的存在，如虫草素与腺苷的含量，但这些标记物容易买到，而且并不贵，理论上可以用来作添加剂，所以理化检验既不能检出杂质，也不能辨别赝品。由于虫草粉价格高昂，为了保护消费者的利益，本领域需要建立准确鉴定纯冬虫夏草粉真伪的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的是市场流通与销售的纯冬虫夏草粉难于分真伪的技术问题。本专利技术解决该问题的技术方案是提供一种准确鉴别冬虫夏草粉的方法。该方法包括以下步骤取待检冬虫夏草粉，染色制成涂片；所述染色为分别进行苏木精-伊红-碘液染色、番红-固绿染色、斯氏染液-碘液染色中的至少一种染色；将制成的涂片于显微镜下进行显微观测，如每片均能清晰观察到冬虫夏草的特有结构，且没有碘液染色下的明显蓝色斑点，并且没有观测到明显的植物组织，即可判断为纯冬虫夏草粉，否则为不纯的冬虫夏草粉。其中，本专利技术中所述的冬虫夏草的特有结构为冬虫夏草的虫体菌丝体、冬虫夏草的虫体表皮层、冬虫夏草的虫体肌肉组织、冬虫夏草的子座菌丝体或冬虫夏草的子座表皮层中的至少4种。其中，本专利技术中所述的冬虫夏草的染色方法为滴加苏木染液IOmin染色后水洗5min，然后依次分别用50 %、75%、95 %乙醇梯度洗，然后滴加伊红染液染色5min，然后滴加碘液染色5min，然后依次分别用50 %、75 %、95 %、100 %的乙醇梯度洗漆，后置于二甲苯液中5 IOmin以完成染色。其中，本专利技术中所述的冬虫夏草的染色方法为将涂片用50 %乙醇浸泡后滴加番红染液25min染色，然后依次分别用50 %、75 %、95 %乙醇梯度洗涤，然后滴加固绿染色lmin，然后依次分别用95^^95^^100%、100%的乙醇梯度洗涤，后置于二甲苯与100%乙醇混合液中5 IOmin,再置于纯二甲苯液中5 IOmin以完成染色。其中，本专利技术中鉴别冬虫夏草的特有结构时，可以用同种方式染色的具有冬虫夏草特有结构的标准切片为标准。还可以用冬虫夏草的虫体横切片和冬虫夏草子座横切片作为参考标准。以防止检验人员由于经验不足产生误判。其中，本专利技术中对每批待检的纯冬虫夏草粉物料取样4 10份。一般取6份进行检测，以提高准确度。对每批待检的纯冬虫的每张涂片中的每I张上都要有至少4种特有结构才为真品。具体而言，本专利技术方法可采用以下的详细实施过程 取待检冬虫夏草粉4 10份，一般取6份。将取的样染色制成涂片；所述染色为分别进行苏木精-伊红染色、番红-固绿染色、斯氏染液染色中的至少一种染色，并进行碘液染色；其中苏木精-伊红染色的方法为滴加苏木染液IOmin染色后水洗5min，然后依次分别用50 %、75 %、95 %乙醇梯度洗涤，然后滴加伊红染液染色5min，然后滴加碘液染色5mint然后依次分别用50%、75%、95%、100%的乙醇梯度洗涤，后置于二甲苯液中5 IOmin以完成染色。其中番红-固绿染色的方法为将涂片用50%乙醇浸泡后滴加番红染液25min染色，然后依次分别用50%、75%、95%乙醇梯度洗涤，然后滴加固绿染色lmin，然后依次分别用95%、95%、100%、100%的乙醇梯度洗涤，后置于二甲苯与100%乙醇混合液中5 IOmin,再置于纯二甲苯液中5 IOmin以完成染色。然后将制成的涂片于显微镜下进行显微观测，如每片均能清晰观察到冬虫夏草的特有结构，且没有碘液染色下的明显蓝色斑点，并且没有观测到明显的植物组织，即可判断为纯冬虫夏草粉，否则为不纯的冬虫夏草粉。所述的冬虫夏草的特有结构为冬虫夏草的虫体菌丝体、冬虫夏草的虫体表皮层、冬虫夏草的虫体肌肉组织、冬虫夏草的子座菌丝体或冬虫夏草的子座表皮层中的至少4种特有结构都能在显微镜下观测到。本专利技术方法的有益效果在于本专利技术主要采用显微染色鉴别的思路，针对冬虫夏草的特殊情况，开发出本专利技术方法。本专利技术方法通过对冬虫夏草微细结构的染色，经过生物显微镜，在不同的放大倍数下，能清晰辨认细小的饮片粉末和分辨出不属于冬虫夏草的物质。而且该方法成本低、效率高，不易受各种添加成分的干扰，准确度非常高，适用于1500目以内的超微粉的鉴别观察。可以单独使用以鉴别纯冬虫夏草超微粉，对判断目前市场销售的冬虫夏草超微粉及冬虫夏草制剂的可信度及纯正度有着十分重要的意义。本专利技术方法可以单独使用确判断珍贵冬虫夏草的真伪，也可以结合其他的冬虫夏草及冬虫夏草超微粉在通过鉴别方法，如虫草性状中形状、色泽、气味与滋味、环纹、虫足的检测；感官品质要求的外观、色泽、气味与滋味；理化指标中对水分、腺苷、杂质、重金属、微生物的检测在判断珍贵冬虫夏草的真伪的基础上确定其质量水平，这对保护消费者的利益有着深远的意义，在本领域有很好的应用前景。附图说明图I为冬虫夏草纵切片(40X)图2为冬虫夏草横切片。左为冬虫夏草虫体横切片(40X)，右为冬虫夏草子座横切片(40X)。图3为虫体菌丝体(100X)图4为冬虫夏草超微粉-虫体菌丝体(100X)，伊红染液。图5为虫体表皮层(100X),苏木染液。图6为冬虫夏草超微粉-虫体表皮层(100X)，伊红染液。图7为虫体肌肉组织(100X)，左为苏木染液；右是伊红染液。图8为冬虫夏草超微粉-虫体肌肉组织(100X)，伊红染液下。图9为子座菌丝体(100X)，左为苏木染液下，右是固绿染液下。 图10为冬虫夏草超微粉-子座菌丝体(100X)，伊红染液下。图11为子座表皮层(100X)，左为苏木染液下，右边是伊红染液下。图12为冬虫夏草超微粉-子座表皮层(100X)，伊红染液下。图13为碘液染色的淀粉颗粒(100X)图14为苏木染液下植物组织一叶(100X)其中图3、5、7、9、11是指在冬虫夏草整体切片上找到的相应典型结构的部分图片(即图1，图2的局部放大图)。图4、6、8、10、12为待测的冬虫夏草超微粉涂片的结果。具体实施例方式五、实验方法及参数I.实验样品冬虫夏草切片、市售极草牌纯冬虫夏草超微粉，淀粉超微粉、淀粉超微粉和纯冬虫夏草超微粉的混合物。2.染色剂固绿染液国药集团化学试剂有限公司；番红染液国药集团化学试剂有限公司；伊红染液沈阳新光化工厂；苏木精染液沈阳新光化工厂；斯氏液北京化工厂；碘南京新化原化学有限公司，按常规方法配成染液。3.仪器或其他用具双筒生物显微镜，照相转接设备，佳能单反相机。酒精灯，载玻片，盖玻片，染色架，香柏油，无水乙醇，二甲苯，加拿大树胶，擦镜纸，蒸馏水等常规器材。4.流程固定一透明一涂片(装片)一染色一封藏一干燥一镜检。5.步骤5. I 固定取搅拌均匀的样品适量，用蒸馏水浸泡4h，再用FAA(甲醛10%，乙醇5本文档来自技高网...

【技术保护点】
鉴别纯冬虫夏草粉的方法，其特征在于：包括以下步骤：取待检冬虫夏草粉，分别染色制成涂片；将制成的涂片于显微镜下进行显微观测，如每片均能清晰观察到冬虫夏草的特有结构，且没有观测到明显的植物组织或没有碘液染色下的明显蓝色斑点，即可判断为纯冬虫夏草粉，否则为不纯的冬虫夏草粉；所述的冬虫夏草的特有结构为冬虫夏草的虫体菌丝体、冬虫夏草的虫体表皮层、冬虫夏草的虫体肌肉组织、冬虫夏草的子座菌丝体或冬虫夏草的子座表皮层中的至少4种；所述染色为进行斯氏染液？碘液染色；所述斯氏染液？碘液染色的步骤为将与斯氏液混匀的样品六组玻片平放于培养皿内，滴加碘液5min，用50％、75％、95％、100％、100％的乙醇洗涤，再置于二甲苯与100％乙醇混合液中5～10min，然后置于二甲苯液中5～10min。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张雪峰，徐丽，
申请(专利权)人：张雪峰，
类型：发明
国别省市：