一种人体液真菌（1,3）-β-D葡聚糖检测试剂盒及其应用方法技术

本发明专利技术提供了一种可产业化生产的，准确、快速、特异性高的人体液真菌（1,3）-β-D葡聚糖检测试剂盒，其特征在于包括：反应主剂、体液处理剂、碱性稀释液、酸性稀释液、无菌水、冻干血清和（1,3）-β-D-葡聚糖质控品,所述反应主剂含有东方鲎血细胞G因子、凝固酶凝固酶原和促活剂。本发明专利技术的检测方法简便、快速、安全，80分钟内可完成10人份的体液样本的（1,3）-β-D-葡聚糖检测，鉴别符合率达100%，且特异性高，可在同一反应时间内鉴别真菌（1,3）-β-D葡聚糖与细菌内毒素。

【技术实现步骤摘要】
,3)-β-D葡聚糖检测试剂盒及其应用方法
本专利技术涉及，3) -β -D葡聚糖检测试剂盒及其应用方法。
技术介绍
近年来，临床上侵袭性真菌感染(invasive fungal infections, IFI)的患病率明显上升。IFI也日益成为导致骨髓及器官移植受者、接受化疗的恶性血液病和恶性肿瘤患者、AIDS以及其他危重病患者的严重并发症及重要死亡原因之一。对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断，当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化代谢后，(1，3)- β -D葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液或其它体液中的β -D葡聚糖含量增高，它在体液中的存在可以很大程度上视为IFI (深部真菌感染)的标志。临床常用的检 测方法是微生物鉴别基质培养法，这种方法培养阳性率低，易误诊，且耗时长(3-7天)，不能为临床及时提供诊疗依据。专利号为4970152 的美国专利〈reagents for determing peptidoglycanand^ -I, 3-glucan> (《肽聚糖和β _1，3-葡聚糖的诊断试剂》)中，提出了一种通过使用组合物，测定肽聚糖或β_1，3-葡聚糖的方法，所述组合物包含蚕幼虫血浆的部分，其能够与β_1，3-葡聚糖或者肽聚糖特异性反应，但不与内毒素反应。在该专利中，能够与β_1，3-葡聚糖特异性反应的组合物通过用亲和色谱除去与肽聚糖反应的物质而获得。该方法的反应组合物，是从蚕幼虫抽取血浆为原料，产品生产要实现产业化，存在较大局限性。公告日为2005年6月15日、公告号为CN1206365C的中国专利技术专利《用于检测(1，3) - β -D-葡聚糖的组合物，其制备方法和检测(1，3) - β D-葡聚糖你试剂盒的》提出了一种用于检测(1，3) - β D-葡聚糖的组合物，利用能够螯合钙离子的螯合剂或缓冲液从步行虫科或金龟子科昆虫的血浆细胞中粗提取组合物，再用钙离子、葡聚糖或乙烯基的树脂色谱柱从粗提取组合物中分离获得在钙离子存在下通过(1，3) -β -D-葡聚糖显示酚氧化酶活性的部分。该方法从昆虫血浆中提取所需原料，量少且来源有限，难以产业化生产；其通过柱色谱法分离有效成分，容易受微生物污染，因这种生物试剂不能高温消毒或灭菌，其产品标准可控性差。该方法，是利用酚氧化酶的活性来定量计算β_1，3-葡聚糖，因脂多糖、肽聚糖等物质也可以激活酚氧化酶，其特异性不强，影响测定结果。公布日为2012年I月4日，公布号为102305787的中国专利技术专利申请《真菌(1-3)_β -D葡聚糖比色检测试剂盒的制备及其使用方法》公开了一种通过利用(1-3)-β -D葡聚糖来激活鲎血G因子，进一步水解显色基质后，通过分光光度计进行吸光度检测来达到检测(l-3)-i3_D葡聚糖的目的。该方法的问题在于所需配置显色试剂较多，操作繁琐，且中间过程中容易有外界细菌污染介入，影响检测结果。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供一种可产业化生产的，准确、快速、特异性高的人体液真菌(I, 3) - β -D匍聚糖检测试剂盒及其应用方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案，3) _β -D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于包括反应主剂、体液处理剂、碱性稀释液、酸性稀释液、无菌水、冻干血清和(1，3)-β -D-葡聚糖质控品，所述反应主剂含有东方鲎血细胞G因子、凝固酶凝固酶原和促活剂。进一步的，所述反应主剂通过包括以下步骤的方法制备(1)将活体鲎用酒精消毒心门采血加抗凝剂后离心收集鲎血细胞，所述抗凝剂与鲎血的体积比为I :6 I :10 ;(2)加裂解液裂解所收集的鲎血细胞，获得鲎血细胞溶解物；(3)分离细胞壁，用有机溶媒氯仿(CHCl3)提取鲎血细胞溶解物，按体积比加入1:0. 8 I: I. 2的氯仿和聚乙二醇8000，使每毫升含聚乙二醇I. 5 3mg,随即混合45 60分钟，然后1500r/min-3000r/min离心30 40分钟，制得反应主剂G因子、凝固酶、凝固酶原活性成分；(4)加入促活剂，按鲎血细 胞提取物体积与促活剂体积比为1:0. 3 1:0. 5的比例加入，搅拌均匀，得到反应主剂半成品，所述促活剂是在纯化水中加入KCl、MgSO4溶液或者KCl、CaCl2溶液，使得每毫升促活剂含KCl O. 15 O. 30M,含MgSO4O. 15 O. 30M或含CaCl2O. 20 O. 40M,过滤分装，用流通蒸汽消毒30 40分钟即可；(5)将配制的反应主剂半成品搅拌均匀-45°C _55°C真空冷冻干燥后20 25°C封口，制得反应主剂成品。进一步的，体液处理剂含有氯化钠、缓血酸铵和稀盐酸，所述体液处理剂的PH值在5. 5 7. 5之间。氯化钠浓度为8. 5mg/ml 15mg/ml,含缓血酸铵浓度为O. 25mg/ml lmg/ml，混合均匀后，过滤分装，用流通蒸汽消毒30 40分钟即可。进一步的，碱性稀释液的PH值在10. 5 13. 5之间。按处方用量分别称取缓血酸铵化学试剂，置投料容器内，添加水至配制量，使得每毫升溶液含缓血酸铵O. 5-1. Omg，混合均匀后，用稀盐酸调节PH值为10. 5 13. 5，过滤分装，用流通蒸汽消毒30 40分钟即可。进一步的，酸性稀释液的PH值在2. O 4. O之间。按处方用量，用稀盐酸或冰醋酸溶液将新鲜蒸馏水的PH值调为2. O 4. 0，混合均匀后，过滤分装，用流通蒸汽消毒30 40分钟即可。进一步的，无菌水为注射用水的重蒸馏水。不含有细菌内毒素或(1，3)-β-D-葡聚糖。进一步的，冻干血清为人血白蛋白或小牛血清。，3) -β -D-葡聚糖检测试剂盒的检测方法，其特征在于东方鲎血细胞中G因子被待检测样本中的(1，3)-β-D-葡聚糖激活，形成凝固蛋白胶，(I, 3)-β-D-葡聚糖的含量越高，则形成凝固蛋白胶反应时间越短，通过采集在不同时间的透光率,进行回归分析(Lgt=a+bIgc )实现对待检测样本中(I，3 ) - β -D-葡聚糖含量的检测，具体实现步骤包括标准曲线制作、体液(1，3) - β -D-葡聚糖的提取纯化、样本阳性液的制备、上机检测。进一步的，在血液基质中，(1，3)-β-D-葡聚糖的线性检测范围为10pg/ml 640pg/mlο进一步的，人体液外加(1，3)-β D-葡聚糖标准溶液的检测回收率为80% 140%。，3 )_ β -D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于主要用于人血液或其它体液中真菌(1，3) - β -D-葡聚糖含量的测定。通过本人体液真菌(1，3) - β -D-葡聚糖检测试剂盒建立的标准曲线的线性系数r ^ O. 99 ;在血液基质中线性检测范围达10pg/ml 640pg/ml ;可实现对(1，3) - β -D-葡聚糖的定性、定量检测；通过在体液样本外加细菌内毒素标准溶液和(1，3)-β-D-葡聚糖标准溶液进行检测回收率试验，内毒素回收率< 5%，证明整个检测试验过程，内毒素对本广品检测(1，3) - β -D-匍聚糖没有影响，同时实现(1，3) - β -D-匍聚糖的回收率达80% 140%，比国际标准要求的50% 200%更加准确。本专利技术的检测方法简便、快速、安全，80分钟内本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人体液真菌（1,3）？β？D？葡聚糖检测试剂盒，其特征在于包括：反应主剂、体液处理剂、碱性稀释液、酸性稀释液、无菌水、冻干血清和（1,3）？β？D？葡聚糖质控品,所述反应主剂含有东方鲎血细胞G因子、凝固酶、凝固酶原和促活剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：莫水晶，莫世文，莫世君，
申请(专利权)人：莫水晶，莫世文，莫世君，
类型：发明
国别省市：