γ-氨基丁酸的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种γ-氨基丁酸的生产方法，属于医药化工技术领域，其特征在于由以甘油、玉米浆、酵母粉、无机盐为原料，加入诱导剂，经大肠杆菌发酵进行酶表达，在发酵过程中补料，然后加入底物进行转化；转化结束后经过陶瓷膜和有机膜进行微滤和超滤，超滤液经过浓缩结晶，过滤，将晶体烘干得到成品。首先利用发酵技术高效表达谷氨酸脱羧酶，通过离心技术出去发酵液中的杂质，然后利用菌体进行转化。大大提高了单位发酵液GABA的产量，工艺简单，降低了生产成本，使GABA实现大规模生产制备，使GABA能得到普遍实际应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种Y-氨基丁酸的生产方法，属于医药化工

技术介绍
Y -氨基丁酸，又名氨酪酸(Gamma-aminobutyric acid, GABA)。其分子式为H2N (CH2)3COOH,相对分子量为103. 2。Y-氨基丁酸(GABA)是一种非蛋白质氨基酸，主要用于医药中间体、营养药等方面。GABA具有安定、抗惊厥、降血压、增进脑活力、营养神经细胞、促进生长激素分泌以及保肝利肾的作用。近年来，国内外市场对Y-氨基丁酸的需求逐年强劲增长。近年来，随着Y -氨基丁酸在医药工业上用途的不断扩大，Y -氨基丁酸成为一种国际市场上发展前景良好、中国市场需求较大的产品。作为一种具有多种生理功能的生物活性因子，GABA在美国、日本等国家已广泛用于营养补充剂和功能食品中，而我国在这方面的研究尚处于起步阶段，亟待发展和提高。Y-氨基丁酸的生产方法有主要有化学合成法、固态发酵法和生物酶转化法。化学合成法主要采用吡咯烷酮、氢氧化钠和水按一定比例混合后，在高温下进行反应，然后通过树脂分离纯化，浓缩结晶而成。吡咯烷酮与氢氧化钠都为腐蚀性物质，影响人体健康。特别是吡咯烷酮在高温下，有引起燃烧的危险，且可分解释放有毒的氧化氮烟气，操作过程存在危险性，不利于工业化大规模生产。固态发酵法效率低下，产量仅为O. 35mg/g，最终纯度只有45%。生物酶转化法以基因工程菌代谢中产生的酶，对底物进行生物转化，直接产出Y-氨基丁酸。生产过程污染小，无危险性，成本低廉，成为目前Y-氨基丁酸主要的生产方式。随着基因工程技术的发展、工业微生物生物化学信息的增多、特别是工业生物载体系统的成功构建，现在研究者开始用基因工程技术构建产Y-氨基丁酸的菌种，为优良的Y-氨基丁酸生产菌株的筛选提供了可靠的技术保障，采用酶法生产Y-氨基丁酸成为一种廉价的工业化生产方法。
技术实现思路
根据现有技术的不足，本专利技术要解决的技术问题是提供一种Y-氨基丁酸的生产方法，大大提高了单位发酵液Y-氨基丁酸(GABA)的产量，降低了生产成本，使GABA实现大规模生产制备。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是提供一种Y-氨基丁酸(GABA)的生产方法，其特征在于由以甘油、玉米浆、酵母粉、无机盐为原料，加入诱导剂，经大肠杆菌发酵进行酶表达，在发酵过程中补料，然后加入底物进行转化；转化结束后经过陶瓷膜和有机膜进行微滤和超滤，超滤液经过浓缩结晶，过滤，将晶体烘干得到成品。所述的诱导剂为异丙基-β -D-硫代半乳糖苷，加入量为O. 005-0. 01g/L。所述的转化过程中加入磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，浓度为磷酸二氢钾浓度5 10g/L，磷酸氢二钾浓度3 8g/L，将转化罐升温至30 45°C，搅拌下酶促转化反应，15-20小时。所述的转化前将菌体分离，按质量体积比1:5 10的比例加入配置好的磷酸二氢钾浓度/磷酸氢二钾缓冲溶液，导入转化罐中，补加谷氨酸及甘油进行转化。所述的底物为谷氨酸，浓度为20 50g/L。所述的补料过程中加入乳糖，乳糖的浓度维持在l_2g/L。本专利技术中的大肠杆菌是通过离心机进行收集的，收率达到95%以上。其中发酵液中生物量80g/L，酶促反应转化率达98%以上，每升转化液中GABA浓度达到 180g/L。本专利技术的有益效果是首先利用发酵技术高效表达谷氨酸脱羧酶，通过离心技术出去发酵液中的杂质，然后利用菌体进行转化。大大提高了单位发酵液GABA的产量，工艺简单，降低了生产成本，使GABA实现大规模生产制备，使GABA能得到普遍实际应用。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术做进一步描述实验材料和方法I、工程菌大肠杆菌基因重组工程菌，该菌种由我公司通过基因重组工程技术构建选育，由我公司生物研究所保藏，保藏日期为2011年6月15日，本基因重组大肠杆菌携带谷氨酸脱羧酶基因。2、发酵培养基种子培养基99% 甘油 20g，酵母浸粉5g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾3g，磷酸氢二钾5g，发酵培养基甘油60g，酵母浸粉12g，玉米浆20g，磷酸二氢钾20g，七水硫酸镁6g，氯化钙I. 2g，硫酸亚铁I. 4g，氯化钠2g，异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG O. Ig,补料培养基补料I :25% 28%氨水，发酵罐自动控制其补加速度，使pH值控制在一定数值。补料2 :甘油1000g，乳糖80g，纯化水定容到2L，115°C灭菌30min。补料3 :谷氨酸1500g。3、发酵工艺3. I发酵第一阶段一种子罐培养阶段5L罐中加入种子培养基后，加水至 2L，种子罐中121°C灭菌30min。温度降至37°C接种，通气比为I: I，此阶段DO和pH持续下降，发酵罐自动补加氨水控制PH5. O 6. O ;通过提高转速提高溶氧，使其不低于30%。此阶段维持16 20h，时间长短根据接种量不同而有所区别，此阶段生物量达30g/L左右。3. 2发酵第二阶段一发酵罐培养阶段IOL罐中加入发酵培养基后，加水至4L，发酵罐中121°〇灭菌301^11。温度降至371后将培养好的种子移种至发酵罐中，通气比为I: I，5h开始补加补料2，通过提高转速提高溶氧，使其不低于30%，发酵液中甘油含量维持在5 10g/L。发酵罐中菌体生长迅速，此阶段时长24h左右，生物量可达80 100g/L。3. 3发酵第三阶段一转化罐转化阶段用纯水将离心出来的菌体溶解，依次加入磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，使其浓度为磷酸二氢钾浓度5 10g/L，磷酸氢二钾浓度3 8g/L。少量多次加入谷氨酸，使谷氨酸浓度维持在20 50g/L，pH4 6，将转化罐升温至30 45°C，通气比为1: 1，200rpm搅拌下酶促转化反应，15小时左右。随时检测谷氨酸含量，转化液中GABA含量达到180g/L转化液时，即可终止转化反应。4、纯化4. I膜过滤将转化液加热至70°C维持5min，然后进行陶瓷膜微滤，将破碎的菌体及部分大分子蛋白质除掉。滤液用截留分子量1000的中空纤维超滤膜，超滤去除陶瓷膜滤液中残留的蛋白质及其他大分子物质。将超滤液进一步进行纳滤脱盐处理，通过纳滤可将转化液中绝大部分的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾除掉。4. 2浓缩结晶GABA易溶于水，在水中溶解度极高，将纳滤液浓缩至GABA含量为60%后，保持搅拌，室温放置。放置12h后，晶体大量析出，此时进行抽滤，并用90%的乙醇对晶体进行洗涤。将处理好的晶体真空干燥，即得白色针状GABA成品，产品纯度可达99. 5%以上。实施例一I、发酵工艺利用5L发酵罐作为种子罐，进行种子培养种子罐培养基99% 甘油 20g，酵母浸粉5g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾3g，磷酸氢二钾5g，5L罐中加入种子培养基后，加水至2L，种子罐中121°C灭菌30min。温度降至37°C接种，通气比为I: I，此阶段DO和pH持续下降，发酵罐自动补加氨水控制pH5. O 6. O ;通过提高转速提高溶氧，使其不低于30%。此阶段维持18h，生物量达30g/L左右。利用IOL发酵罐作为发酵罐，进行菌体培养发酵罐培养基甘油60g，酵母浸粉12g，玉米浆20g，磷酸二氢钾20g，七水硫酸镁6g，氯化钙I. 2g，硫酸亚铁L 4g，氯化钠2g，异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG O. I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种γ？氨基丁酸的生产方法，其特征在于由以甘油、玉米浆、酵母粉、无机盐为原料，加入诱导剂，经大肠杆菌发酵进行酶表达，在发酵过程中补料，然后加入底物进行转化；转化结束后经过陶瓷膜和有机膜进行微滤和超滤，超滤液经过浓缩结晶，过滤，将晶体烘干得到成品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：荣金雷，李江涛，杨修亮，
申请(专利权)人：山东金城钟化生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：