BMP-2亲和肽制造技术

本发明专利技术公开了BMP-2亲和肽。更具体地讲，公开了一种亲和生物基质，其中所述亲和肽共价地连接到可生物降解的生物相容性聚合物。所述亲和生物基质可用于制备BMP-2控释装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的特异性亲和肽。另外，本专利技术涉及这些亲和肽在BMP-2控释装置中的应用。
技术介绍
BMP-2是一种属于称为转化生长因子β (TGF-β)的超家族的蛋白质。已知ΒΜΡ-2可诱导骨和软骨的形成。例如，ΒΜΡ-2已被用于通过手术植入与该蛋白质组合的胶原基质来促进骨修复。ΒΜΡ-2以水性悬浮液的形式加载到可吸收的胶原海绵中。ΒΜΡ-2与胶原非特异性地缔合。然而，由于胶原原纤维对ΒΜΡ-2的低结合能力(反之亦然)，ΒΜΡ-2可能会从胶原基质渗漏出去。ΒΜΡ-2从胶原海绵的这种渗漏会导致在植入部位或其附近出现不良的旺盛骨形成和/或异位骨形成。不良的骨骼生长会引起进一步的并发症，导致病人需要 一项或多项额外矫正手术。因此，需要一种ΒΜΡ-2控释装置来消除在不希望的位置的骨形成的问题性副作用。制备控释装置的标准方法包括使用聚合物基质，通常为微球、棒、片或丸的形式，其用于封装活性剂。已知有多种技术可将活性剂掺入到聚合物基质中。例子包括对具有离散性(discrete)大小或形状的颗粒的溶剂蒸发、喷雾干燥、乳化、熔融共混和简单物理混合。由于肽或蛋白质的微妙性质，这些方法均不可应用于将这些分子掺入到聚合物中。肽和蛋白质容易因为溶剂、乳化、高温和(尤其是)最终灭菌而变性。因此，需要一种制备BMP-2控释装置的方法，并且该方法不会使蛋白质变性或失去活性。还期望一种能提供蛋白质的局部持续释放从而避免不期望的异位骨形成的BMP-2控释装置。
技术实现思路
本文描述了 BMP-2亲和肽。这些亲和肽对BMP-2具有特异性亲和力，可用于制备亲和生物基质。还描述了 BMP-2控释装置，其由亲和生物基质和BMP-2制备而成。附图说明图I.对BMP-2具有特异性亲和力的氨基酸序列(亲和肽)，其包含线性肽和受二硫键约束的肽。图2.控释装置的图形表示，其包含亲和生物基质和BMP-2。图3. BMP-2噬菌体ELISA测定证实了从噬菌体选择产生的噬菌体展示肽结合到BMP-2。图4A.用递增的噬菌体数目/孔进行的验证性和交叉反应性噬菌体ELISA测定，显示出最小交叉反应的结合噬菌体。图4B.用递增的噬菌体数目/孔进行的验证性和交叉反应性噬菌体ELISA测定，显示出高度交叉反应的结合噬菌体。图4C.用递增的噬菌体数目/孔进行的验证性和交叉反应性噬菌体ELISA测定，显示出在高噬菌体浓度(101°个噬菌体/孔)下交叉反应的结合噬菌体。图5A.对人IgG的交叉反应性噬菌体ELISA测定。图5B.对人血清白蛋白(HSA)的交叉反应性噬菌体ELISA测定。图6.亲和肽与BMP-2的浓度依赖性结合，采用放大发光接近均匀测定法(amplified luminescent proximity homogenous assay, ALPHA)。图7.通过评估在存在BMP-2的情况下3天后小鼠(MCH 1/26)成骨细胞的碱性磷酸酶活性得出的亲和肽对BMP-2受体结合的功能干扰。图8A.用于将SEQ ID NO :6缀合到包含乙酰化N端和接头的胶原基质的肽的氨基酸序列(SEQ ID NO 23)。 图8B.耦联了 SEQ ID NO 23后的胶原亲和生物基质的扫描电子显微镜(SEM)图象。图9.加载到胶原生物基质及胶原亲和生物基质盘中的BMP-2的掺入百分比。图10.体外释放研究,示出在36天时间里从胶原生物基质及胶原亲和生物基质盘释放的BMP-2的量。图11A.突变型噬菌体ELISA，示出结合到BMP-2的SEQ ID NO 3片段。图11B.突变型噬菌体ELISA，示出结合到BMP-2的SEQ ID NO 6片段。图12.用于鉴定结合到BMP-2的SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 6片段的氨基酸序列，以及结合到BMP-2的片段的氨基酸序列。图13.体外释放研究，在包含2%热灭活的胎牛血清(FBS)的磷酸缓冲盐水(PBS)中进行，示出在15天时间里从胶原生物基质及胶原亲和生物基质盘释放的BMP-2的量。图14.用于体内笼状植入物测试系统的不锈钢腔室的图象。图15.体内释放研究，示出在7天时间里从胶原生物基质及胶原亲和生物基质盘释放的BMP-2的量。具体实施例方式本文描述了 BMP-2亲和肽。在一个实施例中，BMP-2是重组人BMP_2。BMP-2亲和肽表示该肽对BMP-2具有特异性结合亲和力。该肽可以为线性的或受二硫键约束的。在一个实施例中，BMP-2亲和肽为图I所示亲和肽中的任一个。在另一个实施例中，亲和肽可以是图I所示亲和肽中的任一个的片段。虽然亲和肽具有对BMP-2的特异性亲和力，但是亲和肽不会干扰BMP-2的生物活性。这些亲和肽可用于制备BMP-2控释装置。图I所示的BMP-2亲和肽使用美国专利No. US6472147中所述的pIX噬菌体展示技术进行鉴定。使用高复杂性的初级肽噬菌体文库(每个文库IO9个肽序列)来选择BMP-2亲和肽。更具体地讲，将生物素酰化BMP-2固定在涂布链霉抗生物素蛋白的ELISA板上，并引入在PlX次要外壳蛋白上展示肽序列的噬菌体。将未结合到BMP-2上的噬菌体冲洗掉，并对结合到BMP-2的噬菌体进行分离和扩增。将结合到BMP-2的分离噬菌体作为输入用于按照上述程序进行第二轮选择，共计三轮选择。在第三轮结束时，对结合到BMP-2的噬菌体进行测序以确定负责结合到BMP-2的肽。对BMP-2具有亲和力的肽列于图I中。BMP-2亲和肽可用于制备亲和生物基质。亲和生物基质通过将至少一种如上所述的BMP-2亲和肽共价连接至可生物降解的生物相容性聚合物来制备。此外，亲和生物基质可用作BMP-2控释装置。代表性的实施例以图示方式示出于图2中。BMP-2控释装置包含亲和生物基质和BMP-2。用于制备亲和生物基质的可生物降解的生物相容性聚合物可以是天然聚合物、合成聚合物以及它们的组合。可生物降解的聚合物在暴露于潮湿的身体组织时容易分解成小片段。这些片段随后会被身体吸收或排泄。更具体地讲，由于生物降解的片段被身体吸收或排泄，使得体内不会永久性保留痕量或残余片段，因此不会引起永久性的慢性异物反应。合适的天然聚合物包括但不限于蛋白质，诸如胶原、弹性蛋白、角蛋白、丝、葡糖胺聚糖(GAG)、凝血酶、纤连蛋白、明胶、纤维蛋白、弹性蛋白原、多肽、层粘连蛋白、蛋白聚糖、纤维蛋白胶、纤维蛋白凝块、富血小板血浆(PRP)凝块、贫血小板血浆(PPP)凝块、自组装肽水凝胶和去端肽胶原(atelocollagen);多糖，诸如淀粉、果胶、纤维素、烷基纤维素(如甲基纤维素)、烷基羟烷基纤维素(如乙基羟乙基纤维素)、羟烷基纤维素(如羟乙基纤维素)、硫酸纤维素、羧甲基纤维素的盐、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、几丁质、羧甲基几丁质、透明质酸、透明质酸的盐、藻酸盐、交联藻酸盐藻酸、丙二醇藻酸盐、糖原、葡聚糖、硫酸 葡聚糖、凝胶多糖、果胶、普鲁兰多糖、黄原胶、软骨素、硫酸软骨素、羧甲基葡聚糖、羧甲基壳聚糖、壳聚糖、肝素、硫酸肝素、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、卡拉胶、壳聚糖、淀粉、直链淀粉、支链淀粉、聚-N-葡糖胺、聚甘露糖醛酸、聚葡糖醛酸以及衍生物；聚核苷酸，诸如核糖核酸、脱氧核糖核酸，以及它们的组合。在一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J克赫，DA萨利克，CH方，C杨，A克里西，
申请(专利权)人：先进科技及再生医学有限责任公司，
类型：
国别省市：