用氧结合蛋白提高多杀菌素产生制造技术

本发明专利技术涉及用氧结合蛋白提高多杀菌素产生。本发明专利技术描述了将多核苷酸整合至可用于产生杀虫剂的刺糖多孢菌(S.spinosa)菌种的染色体DNA中，其整合体，以及该整合体的用途。本发明专利技术包括氧结合蛋白VHb的稳定整合和表达，所述稳定整合和表达导致提高的多杀菌素产生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术用于分子遗传学
，其中可将基因整合至刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)的染色体中。一种代谢工程方法包括氧结合蛋白诸如血红蛋白基因在染色体DNA区内的整合和表达，所述整合和表达导致提闻的多杀菌素广生，同时不对刺糖多孢菌的生长或者其它期望代谢特征产生负面影响。
技术介绍
·如美国专利5，362，634所披露，发酵产品A83543是由刺糖多孢菌产生的相关化合物的家族。该家族的已知成员已被称为因子或组分，并且各自给予标识字母代号。这些化合物在下文中称为多杀菌素A、B等。多杀菌素化合物可用于控制蜘蛛、线虫和昆虫，具体为鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Diptera)物种。这些化合物被认为是环境友好的，具有吸引人的毒理学概貌(toxicological profile)。天然产生的多杀菌素化合物是由21碳四环内酯组成的大环内酯类，其包括两个脱氧糖的附接中性糖(鼠李糖)和氨基糖(福乐糖胺)(參见Kirst等人，(1991)。若不存在所述氨基糖，则将所述化合物称为假式元A、D(pseudoaglycone of A, D)等；而若不存在所述中性糖，则将所述化合物称为逆假式元A、D (reverse pseudoaglycone of A, D)等。更优选的命名为将这些假甙元称为多杀菌素A 17-Psa、多杀菌素D 17-Psa等，而将这些逆假甙元称为多杀菌素A 9-Psa、多杀菌素D 9-Psa等。天然产生的多杀菌素化合物可经发酵由刺糖多孢菌菌株NRRL 18395, 18537,18538，18539，18719，18720, 18743和18823以及它们衍生物制备。这些培养物已经进行保藏，并成为美国北方农业研究所保藏中心(the Midwest Area Northern RegionalResearch Center, Agricultura丄 Research Service, United States Department ofAgriculture, 1815 North University Street, Peoria, 111. , 61604)的原种培养物保藏的一部分。美国专利5，362，634及对应的欧洲专利037531681涉及多杀菌素ム、8、(、0、￡、？、6、H和J。这些化合物据称通过培养选自NRRL 18395,NRRL18537,NRRL 18538和NRRL 18539的新型微生物刺糖多孢菌的菌株产生。WO 93/09126涉及多杀菌素L、M、N、Q、R、S和T。其中还讨论了两种产生多杀菌素J的菌株NRRL 18719和NRRL 18720，以及产生多杀菌素Q，R，S和T的菌株NRRL 18823。WO 94/20518和美国专利5，6704，486涉及多杀菌素K、0、P、U、V、W和Y以及它们的衍生物。其中还讨论了产生多杀菌素K的菌株NRRL18743。产生多杀菌素化合物的挑战来自需要鉴定和验证刺糖多孢菌基因组内的中性位点，其中含有基因表达盒的多核苷酸可进行整合和稳定表达。引入的基因表达盒可含有生物合成基因，该生物合成基因提供一种产生可具有不同的杀虫活性谱的多杀菌素新型衍生物的方法，或者除了会赋予现有的多杀菌素产生菌株新的有益特性的其它基因表达盒之夕卜，还能提闻多杀菌素的滴度水平的基因表达盒。鉴定和引入导致多杀菌素化合物的产生提高的基因会是有利的。
技术实现思路
本专利技术涉及将多核苷酸整合至可用于产生杀虫剂的刺糖多孢菌菌种的染色体DNA中的方法，其整合体，以及该整合体的用途。本专利技术还提供含有多杀菌素增强基因的遗传修饰的宿主细胞，所述多杀菌素增强基因整合至刺糖多孢菌基因组中，这导致多杀菌素产生的提高。如此，刺糖多孢菌滴度水平导致摇瓶发酵中A/D产生或J/L产生的改善。·本专利技术还提供用于将氧结合基因整合在刺糖多孢菌内的方法。本专利技术的ー种具体实施方案利用VHb基因编码的多杀菌素增强性质，其中VHb基因表达盒携帯在刺糖多孢菌的染色体上。VHb基因的表达导致改善和提高的多杀菌素产生。同样，刺糖多孢菌的摇瓶发酵中的A/D多杀菌素产生得以提高。附图说明图I描述包含977bp合成DNA片段和pJ201的质粒pDAB109000。图2描述将血红蛋白基因表达盒克隆至PIJ773中得到的质粒PDAB109001。具体实施例方式在刺糖多孢菌的染色体内的整合基因存在多种用途。天然或异源的克隆基因可用于改善多杀菌素的产率以及产生新的多杀菌素。改善的产率可通过将在该菌株中任何限速的酶的基因的复制拷贝整合至该菌株的基因组中得到。在生物合成途径在特定突变体菌株中由于缺乏所需的酶而阻断的情形中，期望的多杀菌素的产生可通过整合所需基因的拷贝得到恢复。在生物合成途径破坏的情形中，可生成不同的前体菌株。本申请示例说明了在刺糖多孢菌中透明颤菌属(Vitreoscilla)血红蛋白基因序列(在下文中称为“VHb”)的过表达导致多杀菌素产生的提高。对于刺糖多孢菌菌株的改善，通过将基因表达盒整合至刺糖多孢菌的基因组中进行多核苷酸的稳定转化。基因的整合通过利用一部分染色体DNA和插入元件的同源重组完成。可将染色体DNA插入刺糖多孢菌基因组中。基于该重组以及其应用的结果，将aac (3) IV和VHb基因表达盒分别在遮蔽蛋白聚酮合成酶(obscurin polyketide synthase) (PKS)基因座处整合至刺糖多孢菌的染色体中，导致天然基因obsA的失活。本文中采用下面定义，这些定义应该用于解释权利要求和说明书。本申请在本专利技术的要素或组分前所用的不定冠词“ー个(a) ”和“ー种(an) ”意在关于该要素或组分的发生(即，出现)次数而言是非限制性的。因此，〃 ー个〃或〃 ー种〃应理解为包括一或者至少ー个(种)，并且所述要素或者组分的単数形式也包括复数，除非数字明显是指単数的。本申请所用的术语“包含”和“包括”是指存在如权利要求中所述的特性、整数、步骤或者组分，但是它并不排除存在或者加入一种或多种其它特性、整数、步骤、组分或它们的组。这意味着“包含”或“包括” 一列要素的组合物、混合物、エ艺、方法、制品或者装置不仅仅限于这些要素，而是可包括未清楚列出的或者其固有的其它要素。本申请所用的“或”是指兼取的和择ー的“或者”。例如，下面任一种满足A或B :A为是(或存在)而B为否(或不存在)，A为否(或不存在)而B为是(或存在)，以及A和B均为是(或存在)。本申请所用术语"约"修饰本专利技术的或者所使用的成分或反应物的数量，其是指，例如通过在现实世界中用于配制浓缩物或者使用溶液的典型的測量和液体处理步骤；通过这些操作中非故意的失误；通过在用于制备组合物或实施方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等等可出现的数量差异。术语〃约〃还涵盖因由具体初始混合物得到的组合物的不同平衡条件引起的不同的量。不论被术语"约"修饰与否，权利要求都包括这些数量的等价物。·本申请所用术语"专利技术"或"本专利技术"是非限制性术语，其意在涵盖所有如说明书所描述和权利要求所述的可能的变体。本申请所用的术语〃多肽〃和〃肽〃可互換使用，指两个或更多个氨基酸通过肽键连接在一起的聚合物。一方面，该术语还包括多肽的表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将多杀菌素滴度提高至少4.6%的方法，包括：a)将氧结合蛋白整合至多杀菌素产生菌株中。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：韩蕾，N芒塞，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：