有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物的提纯方法与应用，涉及一种属于生物医学领域。提供一种具备抗肿瘤的有尾两栖动物新疆北鲵（Ranodon?sibiricus）皮肤分泌物的提纯方法与应用。将新疆北鲵皮肤分泌物用双蒸水冲洗并收集，采用抽滤方法去除杂质；将去除杂质的新疆北鲵皮肤分泌物收集液冷冻后，干燥，浓缩，制成新疆北鲵皮肤分泌物干粉；将新疆北鲵皮肤分泌物干粉保存在冰箱中，应用前PBS溶解后用细菌过滤膜过滤除菌，分装后保存于－20℃冰箱备用。所述有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞的生长具有显著的体外抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种属于生物医学领域，具体涉及分布于新疆的一种有尾两栖动物一新疆北鲵(Ranodon sibiricus)皮肤分泌物的提纯方法以及该分泌物在抗肿瘤方面的应用。
技术介绍
两栖动物皮肤裸露、潮湿，易受外界环境作用。在长期进化中，该类生物皮肤腺高度进化且发达，其作用除保持身体湿润外，对抵抗微生物、病毒、甚至天敌的侵害至关重要。两栖类皮肤腺几乎遍布周身，可分为三类粘液腺、颗粒腺、泡状腺，前两类皮肤腺占绝大多数(赖仞等.两栖类皮肤活性肽与活性生物胺[J].大自然探索，1999，18出7):71-74)。粘液腺分布全身体表，分泌出清澈粘液，覆盖在身体表面形成一层湿润的薄膜，具有防御、繁殖、保湿、皮肤呼吸、温度调节、PH调节等作用；颗粒腺作为两栖类特有的一种毒腺，主要分布于背部和尾部(有尾类)，研究发现，其分泌物有防御功能，含有复杂的生物活性物质，具有特殊的生理和药理作用，也是作为中药材的物质基础。上世纪70年代人们开始从两栖类皮肤分泌液中寻找具有药用价值的活性物质，主要以筛选具抗菌及抗肿瘤功效的活性物质为主。其中抗菌肽成为热点研究物质，该类物质是一类氨基酸数量较少的具有抗菌作用的小肽蛋白质，由于不仅具有毒副作用小、热稳定性好、抗菌谱广等特点，而且其抗菌机理不同于普通抗生素，不易产生抗药菌株，有望成为新一代的抗细菌、抗病毒及抗癌药物的新来源(姜丽丽等.蛙类皮肤及其分泌物中生物活性肽的研究进展[J].中国生化药物杂志，2005. 26(4):246-249)。美国费城马盖宁制药公司于1990年开始对青蛙皮肤抗菌肽进行结构与分子设计，筛选出一种对病毒和肿瘤细胞均有杀伤作用的小肽MA1-78。两栖类已被认为是一种极有开发前景的药物资源库(Clarke B T.1997. The nature history of amphibian skin secretions, their normalfunction and potential medical applications[J]. Biol. Rev,72(3):365-379)新疆北鲷(Ranodon sibiricus)又名中亚北鲷、西伯利亚鲷,隶属两栖纲,有尾目，小鲵科，北鲵属，是新疆产唯一的有尾两栖动物，仅分布在中国新疆和哈萨克斯坦边境地区的西天山分支及阿拉套山一带，栖息地海拔介于2100 3200m的山间泉水小溪中。新疆北舰的生存条件恶劣除闻纟韦度、闻海拔、闻寒等地理气候环境外，在其生活的溪水和岸边有大量枯枝败叶、水绵青苔、腐殖质；不时有牛羊经过饮水，还在其栖息地排下粪便；新疆北鲵越冬也主要栖息在栖息地周围的地下暗泥石流中，这些都是导致微生物繁衍滋生的有利条件，而新疆北鲵在这种环境中生存，并存活至今，其皮肤在适应环境、繁衍进化、抑制微生物滋生等方面起到重要作用。在人工饲养新疆北鲵时，每当用手抓完新疆北鲵后，其皮肤分泌的粘性物质很难从手上洗去，且保留时间较长。吴敏等(吴敏等.新疆北鲵皮肤组织学观察[J].两栖爬行动物学研究，1995，(4，5) :39-42)对新疆北鲵皮肤的组织学进行了观察，结果表明，其皮肤不仅有丰富的粘液腺体，在背、尾部还布满了颗粒腺体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具备抗肿瘤的有尾两栖动物新疆北鲵(Ranodonsibiricus)皮肤分泌物的提纯方法与应用。所述有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物的提纯方法如下I)将新疆北鲵皮肤分泌物用双蒸水冲洗并收集，采用抽滤方法去除杂质；2)将去除杂质的新疆北鲵皮肤分泌物收集液冷冻后，干燥，浓缩，制成新疆北鲵皮肤分泌物干粉； 在步骤2)中，所述冷冻的条件可为置于一 80°C超低温冰箱冷冻24h ;所述干燥可采用真空干燥。3)将新疆北鲵皮肤分泌物干粉保存在冰箱中，应用前PBS溶解后用细菌过滤膜过滤除菌，分装后保存于一 20°C冰箱备用。所述有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞的生长具有显著的体外抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物，尤其是制备抗肺癌、子宫颈癌和肝癌等药物。具体说明本专利技术实现的药效和潜在效果如下I)新疆北鲵皮肤分泌物抑制肿瘤细胞生长的作用新疆北鲵皮肤分泌物能显著抑制肿瘤细胞A549 (人肺癌细胞细胞株)、Hela (人子宫颈癌细胞株)和HepG2 (人肝癌细胞株)的生长，抑制上述三种肿瘤细胞的半数致死浓度(LC50)明显小于5-氟尿嘧啶(5-FU)，半数致死浓度分别为:A549 细胞 7. 27μ g/ml、Hela 细胞 9. 967 μ g/ml、H印G2 细胞 11. 29μ g/ml。新疆北鲵皮肤分泌物具有较强的肿瘤抑制作用。2)新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞的抑制作用主要发生在细胞周期的S期经细胞凋亡流式实验验证，经分泌物样品处理后的肿瘤细胞，在S期凋亡的细胞和碎片数显著高于同样处理的Gl期和G2期，也明显高于未经处理的对照组。新疆北鲵分泌物对肿瘤细胞的抑制作用主要发生在肿瘤细胞DNA合成的S期阶段。3)新疆北鲵皮肤分泌物可破坏肿瘤细胞的细胞膜结构通过扫描电镜观察，新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞的抑制，通过破坏肿瘤细胞的细胞膜结构，致使细胞质外溢，细胞皱缩，形态结构发生改变，从而导致肿瘤细胞的死亡。4)新疆北鲵皮肤分泌物对体外培养的人脐带血管内皮细胞生长无明显的抑制作用，说明该分泌物对正常细胞的生长没有明显作用。附图说明图I为新疆北鲵皮肤分泌物对Hela肿瘤细胞体外抑制效果(MTT方法)。IC50为肿瘤细胞生长抑制一半时皮肤分泌物浓度；图中数据是，Hela细胞生长抑制一半时皮肤分泌物；横坐标为浓度对数值Concentration log value,纵坐标为抑制率Inhibition ratio。图2为新疆北鲵皮肤分泌物对A549肿瘤细胞体外抑制效果(MTT方法)。IC50为肿瘤细胞生长抑制一半时皮肤分泌物浓度；图中数据是，A549细胞生长抑制一半时皮肤分泌物浓度为7. 27 μ g/ml、横坐标为浓度对数值Concentration log value,纵坐标为抑制率Inhibition ratio。图3为新疆北鲵皮肤分泌物对IfepG2肿瘤细胞体外抑制效果(MTT方法)。IC50为肿瘤细胞生长抑制一半时皮肤分泌物浓度；图中数据是，HepG2细胞生长抑制一半时皮肤分泌物浓度为11. 29 μ g/ml ;横坐标为浓度对数值Concentration log value,纵坐标为抑制率 Inhibition ratio。图4为新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞体外作用效果图。在图4中，C为没有用药的对照组，K为没有细胞的空白组，Tl T6为不同浓度药物作用组；标尺为100 μ m。图5为阳性对照药5-FU对肿瘤细胞体外作用效果图。在图5中，C代表没有用药 的对照组，K为没有细胞的空白组，Tl T6为不同浓度药物作用组；标尺为100 μ m。图6为新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞作用的超微结构图。在图6中，Cl，C2，C3分别代表对照组不同倍数扫描电镜图；τ ，Τ2，Τ3分别代表用药组细胞扫描电镜图；图中下方数据为电镜放大倍数。图7为正常肿瘤细胞流式细胞分析图。在图7中，横坐标为细胞凋亡组AnnexinLOG,纵坐标为死亡的细胞PI LOG。图8为新疆北鲵皮肤分泌物对本文档来自技高网...
【技术保护点】
有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物的提纯方法，其特征在于包括以下步骤：1）将新疆北鲵皮肤分泌物用双蒸水冲洗并收集，采用抽滤方法去除杂质；2）将去除杂质的新疆北鲵皮肤分泌物收集液冷冻后，干燥，浓缩，制成新疆北鲵皮肤分泌物干粉；3）将新疆北鲵皮肤分泌物干粉保存在冰箱中，应用前PBS溶解后用细菌过滤膜过滤除菌，分装后保存于－20℃冰箱备用。
【技术特征摘要】
1.有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物的提纯方法，其特征在于包括以下步骤 1)将新疆北鲵皮肤分泌物用双蒸水冲洗并收集，采用抽滤方法去除杂质； 2)将去除杂质的新疆北鲵皮肤分泌物收集液冷冻后，干燥，浓缩，制成新疆北鲵皮肤分泌物干粉； 3)将新疆北鲵皮肤分泌物干粉保存在冰箱中，应用前PBS溶解后用细菌过滤膜过滤除菌，分装后保存于一 20°C冰箱备用。2.如权利要求I...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁亮，王秀玲，叶小芳，周克夫，蔡报伟，王晗，季荣，
申请(专利权)人：新疆师范大学，厦门大学，
类型：发明
国别省市：
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