本发明专利技术涉及一种乌贼墨肽聚糖的制备方法和应用，其特征在于步骤为：将乌贼墨匀浆，丙酮脱脂，用Tris-Hcl缓冲液提取，离心后超滤，然后乙醇沉淀和sevag试剂除蛋白，旋转蒸发，冷冻干燥；接着分别采用DEAE-52离子交换层析柱和Sephadex?G-75凝胶柱色谱进行分离纯化，收集洗脱液，冷冻干燥得到乌贼墨肽聚糖。本发明专利技术提取条件简便、操作易控制，制备成本较低，同时所制得的肽聚糖对人前列腺癌细胞DU-145、PC-3具有很强的细胞抑制增殖作用，并且随药物浓度及作用时间的增加，细胞抑制率也明显增加，与为抗前列腺癌提供了一条可行性研究途径，因此具有医学药用价值，易于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种乌贼墨肽聚糖的制备方法，尤其是ー种采用水提法提取乌贼墨肽聚糖的制备方法，本专利技术还公开了该乌贼墨肽聚糖在人前列腺癌上的应用。
技术介绍
乌贼(Sepia)属于软体动物门头足纲乌贼目乌贼科。乌贼的营养丰富，除可食用夕卜，还具有很好的药用价值。尤其是乌贼的墨汁，含有多糖类活性物质黑色蛋白，有明显的抗肿瘤活性。现有研究表明，乌贼墨具有抗肿瘤、提高免疫、抗菌、止血和延缓衰老等作用。乌贼墨作为ー种废弃物，国内外的科学家们对其抗肿瘤活性进行研究，发现具有多种抗肿瘤机制，如提高免疫，诱生细胞因子，抑制癌细胞增长的作用。国内的文献可以參考《中医中 药》2002年第19卷第10期，张永军等著的“复方乌贼墨胶囊对小鼠细胞免疫功能的促进作用”，又可以參考《福建中医学院学报》2004年第14卷第I期，黄枚所著的“乌贼墨抗癌活性的实验研究”，再可以參考《临床药物学》2005年第11卷第9期，王欣等所著的“乌贼墨的药理作用研究进展”。这些充分说明了乌贼墨中含有显著的抗肿瘤活性物质，且在抗肿瘤药物和功能产品开发中具有明显的潜在价值，也为充分利用海洋生物资源提供了有意义的途径。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供ー种操作方便的乌贼墨肽聚糖的制备方法，所制备的乌贼墨肽聚糖活性高、抗肿瘤效果显著。本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种乌贼墨肽聚糖在人前列腺癌上的应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为一种乌贼墨肽聚糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤I)取新鲜乌贼墨匀浆，用丙酮脱脂；2)加入2 5倍体积的0. 08 0. 12M浓度的Tris-Hcl缓冲液在3-5°C下浸泡8 24h进行提取，离心后超滤，或者多次上述重复提取、离心，然后合并每次上清液、再超滤；こ醇沉淀和sevag试剂除蛋白，旋转蒸发，冷冻干燥；3)DEAE-52离子交换层析柱分离，将步骤2)中的冷冻干燥物分别用Tri S-Hcl缓冲液，NaCL溶液0. lmol/L lmol/L进行梯度洗脱，紫外280nm检测吸光度，同时采用苯酚-硫酸法检测糖峰，收集峰值洗脱液，在490nm处检测糖峰，收集最佳峰的洗脱液，透析除盐，冷冻干燥；4)采用S印hadex G-75凝胶柱色谱分离纯化，于280nm处检测，收集洗脱液，冷冻干燥；5)将步骤4)所得样品进行纯度检测，通过高效液相和SDS-PAGE凝胶电泳。作为优选，所述步骤I中的丙酮脱脂为在匀浆液中加入2 4倍体积的丙酮于-15 -25°C中进行脱脂。作为优选，所述步骤2)中的sevag试剂的配比为氯仿与正丁醇的体积比例3 I。进ー步优选,所述步骤3)中的梯度洗脱的洗脱速度Iml I. 5ml/min,姆管4 6ml o最后，所述步骤4)所述的S印hadex G_75凝胶柱色谱分离的步骤为将步骤②所得样品溶于蒸懼水，过G-75凝胶柱,洗脱速度0. 8ml I. 5ml/min,与280nm处检测，收集洗脱液，冷冻干燥。一种乌贼墨肽聚糖在人前列腺癌上的应用。如在抗前列腺癌DU-145细胞抑制增殖上的应用，或者，在抗前列腺癌PC-3细胞抑制増殖上的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点在于提取条件简便、操作易控制，且制备成本较低，同时所制得的肽聚糖对人前列腺癌细胞DU-145、PC-3具有很强的细胞抑制増殖作用， 并且随药物浓度及作用时间的増加，细胞抑制率也明显增加，与为抗前列腺癌提供了一条可行性研究途径，因此具有医学药用价值，易于推广应用。附图说明图I为DEAE-52洗脱峰值图；图2为G-75洗脱峰值图；图3为柱子洗脱后样品的高效液相检测乌贼墨肽聚糖纯度检测图；图4为SDS-PAGE电泳条带图；图5紫外全波长扫描图；图6为红外光谱扫描具体实施例方式以下结合附图实施例对本专利技术作进ー步详细描述。I 材料I. I动物乌贼购自舟山菜场，剥下墨囊_20°C冷藏备用。I. 2细胞株人前列腺癌细胞DU-145和PC_3均购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库。I. 3主要试剂HamF12培养基，Gibco公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物制品有限公司；萄聚糖凝胶S印hadex G-75和DEAE-52阴离子交换柱均购自于上海源叶生物科技有限公司；MTT均购自美国SIGMA公司；ニ甲基亚砜购自美国AMRESC0公司；こ腈购自宁波海曙恒隆实验器材有限公司；其余试剂均为分析纯。I. 4主要仪器DS-I组织捣碎机，上海标本模型厂；BSA124S型电子天平，德国Sartorius AG公司；SSW-420-2S恒温水浴锅，上海民仪电子有限公司；BSW-100-Z⑶自动部分收集器，上海琪特分析仪器有限公司；BT1-100恒流泵，上海琪特分析仪器有限公司；PHS-250PH计，上海理达仪器厂；CF16RX TI日立低温离心机，日本日立公司；752FC紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；LGJ-18冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；高效液相色谱仪(P1201依利特)，大连依利特分析仪器有限公司；MSC300超滤杯(超滤膜3KDa)，上海摩速科学器材有限公司；超净台Forma3111，上海智城分析仪器制造有限公司；细胞培养箱ZHJM-C12090，杭州宝城生物科技有限公司； 酶标仪(美国BI0-RAD)，杭州宝城生物科技有限公司；微量震荡器，上海精密仪器有限公司。2 方法2. I肽聚糖制备和质构研究2. I. I样品提取从乌贼中取出墨囊，破坏墨囊，用组织捣碎机捣碎，收集乌贼墨，然后向乌贼墨中加入2倍体积的丙酮置于-20°C中脱脂12h，过滤，收集残留物，冷冻干燥备用。向乌贼墨加中入3倍体积的Tris-Hcl缓冲液(PH6. 8)，在4°C下浸泡24h，然后在IOOOOrpm下离心25min,去上清液，再将沉淀物中加入3倍体积的Tris-Hcl缓冲液(PH6. 8)，在4°C下浸泡24h，然后在IOOOOrpm下离心25min，去上清液，合并2次上清。用3000的超滤膜超滤，除去部分杂质，加入5倍体积的无水こ醇沉淀，在4°C下浸泡12h，去掉上清液，收集沉淀，将肽聚糖提取物溶于Tris-Hcl缓冲液中，加入sevag试剂(氯仿与正丁醇的比例为3 1)，4°C过夜分层，倒出上清液，重复操作2次，去除游离的蛋白等杂质，旋转蒸发，冷冻干燥备用。2. I 2样品分离纯化将上述冷冻干燥物过DEAE-52离子交换层析柱(I. 6*40cm)，分别用Tris-Hcl缓冲液，NaCL溶液0. Imol/L、0. 3mol/L和0. 5mol/L4个梯度进行梯度洗脱，洗脱速度lml/min，每管4ml，紫外280nm检测吸光度，同时采用苯酚-硫酸法检测糖峰，收集峰值洗脱液，在490nm处检测糖峰，收集最佳峰的洗脱液，透析除盐，冷冻干燥。将上述冷冻干燥后的样品溶于蒸馏水，过S印hadex G_75 (3. 6*50cm)，洗脱速度0. 8ml/min,6min/管,与280nm处检测，收集洗脱液,冷冻干燥。2. 1.3高效液相检测肽聚糖纯度色谱条件=IOOO-IO-C18 (10 X 250mm)色谱样；流动相こ睛-水(I 4);体积流量:1. Oml/min ;上样量20u L ;检测波长:280nm。2. I. 4聚丙本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乌贼墨肽聚糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)取新鲜乌贼墨匀浆，用丙酮脱脂；2)加入2～5倍体积的0.08～0.12M浓度的Tris？Hcl缓冲液在3？5℃下浸泡8～24h进行提取，离心后超滤，或者多次上述重复提取、离心后，然后合并、超滤；再乙醇沉淀和sevag试剂除蛋白，旋转蒸发，冷冻干燥；3)采用DEAE？52离子交换层析柱分离，将步骤2)中的冷冻干燥物分别用Tris？Hcl缓冲液，NaCL溶液0.1mol/L～1mol/L进行梯度洗脱，紫外280nm检测吸光度，同时采用苯酚？硫酸法检测糖峰，收集峰值洗脱液，在490nm处检测糖峰，收集最佳峰的洗脱液，透析除盐，冷冻干燥；4)采用Sephadex？G？75凝胶柱色谱分离纯化，于280nm处检测，收集洗脱液，冷冻干燥；5)将步骤③所得样品进行纯度检测，通过高效液相和SDS？PAGE凝胶电泳。
【技术特征摘要】
1.一种乌贼墨肽聚糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤 1)取新鲜乌贼墨匀浆，用丙酮脱脂； 2)加入2 5倍体积的0.08 0. 12M浓度的Tris-Hcl缓冲液在3_5°C下浸泡8 24h进行提取，离心后超滤，或者多次上述重复提取、离心后，然后合并、超滤；再こ醇沉淀和sevag试剂除蛋白，旋转蒸发，冷冻干燥； 3)采用DEAE-52离子交换层析柱分离，将步骤2)中的冷冻干燥物分别用Tris-Hcl缓冲液，NaCL溶液0. lmol/L lmol/L进行梯度洗脱，紫外280nm检测吸光度，同时采用苯酚-硫酸法检测糖峰，收集峰值洗脱液，在490nm处检测糖峰，收集最佳峰的洗脱液，透析除盐，冷冻干燥； 4)采用SephadexG-75凝胶柱色谱分离纯化，于280nm处检测，收集洗脱液,冷冻干燥； 5)将步骤③所得样品进行纯度检测，通过高效液相和SDS-PAGE凝胶电泳。2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述步骤I中的丙酮脱脂为在匀浆液...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁国芳，郑玉寅，杨最素，杨永芳，王加斌，黄芳芳，郁迪，庄黛娜，李荣，
申请(专利权)人：浙江海洋学院，
类型：发明
国别省市：
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