本发明专利技术公开了剪切因子癌蛋白SF2/ASF在制备白血病治疗药物中的应用。本发明专利技术还提供抑制剪切因子癌蛋白SF2/ASF表达的小干扰RNA及其编码基因和载体。实验证明，利用RNA干扰技术抑制白血病细胞中序列表序列9所示剪切因子癌蛋白SF2/ASF的表达，可明显提高白血病细胞的早期凋亡比例。本发明专利技术为白血病治疗提供了一个新的靶点，在医学领域具有十分广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及剪切因子癌蛋白SF2/ASF在制备白血病治疗药物中的应用。
技术介绍
选择性剪接是当前肿瘤学的研究热点之一，研究认为它参与了肿瘤的发生过程。SF2/ASF蛋白是一类由 SFRS1(Serine/Arginine-rich Splicing Factorl)基因编码的具有典型SR (Serine/Arginine-rich)结构特征的剪接因子,而SR蛋白家族是一类富含精氨酸和丝氨酸序列的结构域蛋白质，不仅参与前体mRNA的组成性剪接，也是选择性剪接的重要调节因子。SR蛋白可调节许多已知原癌基因及肿瘤抑制基因的选择性剪接，于转录后水平激活它们，从而导致细胞的生长和繁殖失控。Yea等报道，转录因子KLF6的异构体KLF6-SV1在肝细胞癌中明显增高，使细胞无限增殖导致肝癌的发生。此外，它们还参与一系列剪接后事件:mRNA核质运输、mRNA衰减和mRNA翻译等。SR蛋白的本质是mRNA代谢的调节因子， 一旦功能受到破坏，将导致发育障碍和疾病发生。SF2/ASF蛋白在蛋白质-蛋白质及蛋白质-RNA互作、胞内定位及运输、以及前体mRNA的选择性剪接中起重要作用。在不同组织中，SF2/ASF的表达受到严格调控，它的表达量对于细胞和机体稳定发挥生理功能具有极其重要的作用。SF2/ASF蛋白的表达量可调控原癌基因Ron的选择性剪接，并在肿瘤浸润时影响细胞的粘着和迁移性。研究发现SF2/ASF蛋白在许多肿瘤中存在过表达现象。Karni等发现，SF2在各种人类肿瘤中均表达上调，部分是由于SFRSl基因扩增所导致的表达上调的人类肺癌细胞系中恢复SF2/ASF正常表达可逆转细胞系的转化状态；在成纤维细胞中异位高表达SF2/ASF蛋白能够诱导细胞发生转化，导致裸鼠体内形成肿瘤，由此得出SF2/ASF是一个原癌蛋白。此外，SF2/ASF在 mTOR (mammalian target of rapamycin)信号通路中也起着非常重要的作用。现已明确mTOR信号通路在许多肿瘤中被激活，该通路的阻滞剂已作为临床抗癌药物进入临床II期试验。研究发现，SF2/ASF可改变mTOR信号通路的活性，并特异性激活该通路中的mTORCl分支。采用RNAi干扰技术抑制mTOR通路，可去除SF2过表达细胞的致瘤能力。此外，SF2表达上调的肿瘤对mTOR抑制剂具有很高的敏感性。白血病是儿童时期最常见的恶性肿瘤和最常见的死亡原因。我国每年新发儿童白血病I. 5万例左右,其中儿童急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL)是最常见的类型，占儿童白血病的75%。20世纪80年代后，由于多药联合强化疗及有力的支持治疗，儿童ALL的治愈率已达80%左右，但近30年来ALL治愈率无明显提高，主要原因是白血病的发病机理至今不明。此外，白血病复发也是重要因素之一。目前儿童白血病的复发率闻达15%左右，已成为影响白血病患儿康复的最关键因素，不仅给患儿本身、而且给家庭及社会带来了不可弥补的严重伤害和不和谐因素
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种剪切因子癌蛋白SF2/ASF在制备白血病治疗药物中的应用。所述剪切因子癌蛋白SF2/ASF的全长cDNA如序列表序列10所示，第210-956位为开放阅读框，编码序列表序列9所示的蛋白。本专利技术提供抑制或降低剪切因子癌蛋白SF2/ASF表达的可生成小干扰RNA的短发夹RNA，其核苷酸序列由一个茎环序列及两个分别位于所述茎环序列两侧的反向重复序列组成，所述两个反向重复序列分别为序列表序列I和序列表序列2所示序列；或，序列表序列3和序列表序列4所示序列。本专利技术还提供由所述短发夹RNA衍生的如下I)或2)的小干扰RNA I) 一条链的核苷酸序列如序列表序列I所示，另一条链的核苷酸序列如序列表序列2所示；2) 一条链的核苷酸序列如序列表序列3所示，另一条链的核苷酸序列如序列表序列4所示。 本专利技术还提供所述RNA (即所述短发夹RNA和所述小干扰RNA)的编码基因。所述基因是由序列表序列5和序列表序列6的单链DNA组成的双链DNA分子，或由序列表序列7和序列表序列8的单链DNA组成的双链DNA分子。本专利技术还提供含有所述基因的表达所述RNA (即所述短发夹RNA和所述小干扰RNA)的重组表达载体。所述重组表达载体是将所述基因插入载体pDsU6或GFP_pDsU6的多克隆位点间得到的重组载体。所述GFP_pDsU6的构建方法如下以pEGFP_Nl (购自Clontech)为模板，在引物Pl (5，-AAGGATCCATTACCGCCATGCATTAG-3’)和 P2 (5，-CCTACGCCTTAAGATACATTG-3’)的引导下PCR扩增GFP基因，扩增产物经BamH I单酶切，连入载体pDsU6的Afl II和BamH I的位点间得到的重组载体。本专利技术还提供含有所述RNA或所述基因的重组菌或重组细胞系。本专利技术还提供一种治疗和/或预防白血病的产品(或药物)，所述产品(或药物)的活性成分中含有所述RNA、基因、重组表达载体和/或重组菌；所述产品(或药物)的活性成分中还含有长春新碱和/或阿糖胞苷。本专利技术保护序列表序列9所示蛋白作为靶点在开发预防和/或治疗白血病产品(或药物)中的应用。本专利技术保护抑制序列表序列9所示蛋白表达的物质在制备预防和/或治疗白血病产品(或药物)中的应用。本专利技术保护任一所述的RNA、基因、重组表达载体、重组菌或重组细胞系在制备治疗和/或预防白血病产品(或药物)中的应用。所述治疗和/或预防白血病产品(或药物)具有下述a)和b)至少一种特性a)降低或抑制白血病细胞中序列表序列9所示蛋白的表达；b)提高白血病细胞早期凋亡比例。所述白血病细胞具体可为B淋巴细胞白血病细胞。实验证明，以剪接因子癌蛋白SF2/ASF的mRNA为靶点，将RNA干扰重组表达载体GFP-pDsU6-sh-l和GFP-pDsU6-sh-2转入B淋巴细胞白血病的细胞系Nalm-6中获得的白血病重组细胞，其剪接因子癌蛋白SF2/ASF表达水平明显低于对照；细胞早期凋亡比例分别为9. 4%和4. 9%，是对照的3倍和I. 5倍；经I ii g/ml化疗药物长春碱处理后，重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l和Nalm-6/pDsU6-sh_Luc的早期凋亡比例分别为23. 0%和17. 6% ;经50 u g/ml阿糖胞苷处理后，重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l和Nalm-6/pDsU6-sh-Luc的早期凋亡比例分别为50. 3%和30. 2% ;经45 u g/ml生理盐水处理后，重组白血病细胞Nalm-6/GFP-pDsU6-sh-l和Nalm-6/pDsU6-sh_Luc的早期凋亡比例分别为8. 3%和 4. 2%o本专利技术证明剪接因子癌蛋白SF2/ASF是一个抗凋亡因子，在ALL细胞中具有抑制细胞凋亡的作用，干扰SF2/ASF的表达可促进肿瘤细胞白血病细胞发生凋亡，并增加白血病细胞对化疗药物的敏感性。本专利技术为白血病治疗提供了一条新的途径，剪接因子癌蛋白SF2/ASF有望成为抗白血病治疗的一个潜在靶点，在医学领域具有十分广阔的应用前景。附图说明 图I为RN本文档来自技高网...
【技术保护点】
短发夹RNA，其核苷酸序列由一个茎环序列及两个分别位于所述茎环序列两侧的反向重复序列组成，所述两个反向重复序列分别为序列表序列1和序列表序列2所示序列；或，序列表序列3和序列表序列4所示序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑胡镛，鲍时来，张寒，杜超豪，邹丽敏，郜慧芳，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京儿童医院，中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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