本发明专利技术公开了一种含有拟南芥钾离子转运体基因AtKUP1且能提高植物钾素胁迫耐受能力的专用植物表达载体pK2-35S-AtKUP1，本发明专利技术使用RT-PCR的方法从植物拟南芥中克隆出AtKUP1基因，用35S启动子控制其在植物体内过量表达，并通过转化法将其转入植物中，实验结果表明在转基因植物中AtKUP1基因能够正常转录，在低钾营养条件下，转入AtKUP1基因的植株生长情况比对照的野生型植株要好，说明过量表达AtKUP1基因能够提高植物吸收利用钾的能力，从而满足植物生长发育的需要，本发明专利技术提供的载体适用于农作物的分子育种，提高其钾素利用率及对低钾胁迫的耐受力，能在钾素不足的情况下获得较高产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物工程领域，具体涉及ー种钾离子转运体基因的植物表达载体^2-HAtKUPl，其构建方法及其在转基因作物中的应用。
技术介绍
钾是植物生长过程中需要的重要营养元素之一，也是植物生长发育所必需的唯一的一价阳离子，它在植物生长发育过程中起着重要的作用，具有重要的生理功能。缺钾会影响多种代谢过程，包括光合作用、蛋白生物合成、滲透调节、膨压的驱动，以及維持膜电势等。近年来，人们对植物吸收利用钾的生理机制和遗传机制进行了较为深入的研究，发现植物体内K+吸收过程主要是通过两个机制进行的，一种是在高钾离子浓度(1-10 mmol/L) 下由钾离子通道參与的低亲和性吸收机制，另ー种是在低钾离子浓度(1-200 μ mol/L)下由钾离子转运体介导的高亲和性吸收机制。目前已从多种植物中克隆出多个编码K+通道及K+转运体的基因。从植物体中克隆得到的K+转运体根据其同源性可分为三个家族KT/HAK/KUP家族，TRK/HKT家族和阳离子质子反向转运体(CPA)家族。植物体中的TRK/HKT家族一方面參与K+运输，另一方面与Na+运输以及盐耐受性相关。植物中第一个克隆到的HKT/Trk基因是小麦的TeiHKTl,它ー方面介导K+运输(Schachtman D. P.和 Schroeder J. I. , 1994),另一方面參与 K+-Na+ 同向转运(Rubio F.,Gassmann ff. , Schroeder, J. I. , 1995-1996)。在水稻中发现的多个 HKT/Trk 转运体中0sHKT2与TaHKTl 一祥，编码K+ =Na+同向转运体蛋白，而OsHKTl与拟南芥AtHKTl功能类似，单向介导 Na+运输(Horie T. , et al. 2001; Garciadeblas B. , et al. 2003)。CPA是广泛存在的一类反向转运体家族，除植物外，它还普遍存在于真菌、动物和细菌中。最初发现它是做为Na+/H+反向转运体參与盐胁迫过程，后期研究证明有几个CPAs參与K+运输。CPA包含两个亚家族CPA1和CPA2。首先鉴定出的CPAl成员是拟南芥这是ー个质膜Na+/K+反向转运体,对盐胁迫非常敏感(Gong D.，et al. 2004),后来又陆续鉴定出了 (Qiu Q. S.，et al. 2004)和diyWZS (An. R. , et al. 2007)。随后，在日本牵牛花(Ohnishi M. , et al. 2005)和水稻(Blumwald E. , et al. 1985)中也发现了类似的K+/H+和K+/Na+的反向转运体。对于CPA2转运体，主要包括拟南芥中发现的6个成员JiZE彳7づ(K + exchange antiporter),參与钾离子装载过程；拟南芥^iCKi77(CellierF·，et al. 2004)和马铃薯 ZevWU (Venema K.，et al. 2003)，參与维持盐胁迫下的 K+动态平衡以及PH值的调控。KUP/HAK/KT 家族最早是在大肠杆菌(Bscherichia coli) (Schroeder, et al.1994)和许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis) (Banuelos, et al. 1995)中鉴定得到的。后来又在多种植物中发现了同源的钾离子转运体。1997年，Santa-Maria G. E.等首先从大麦中分离得到了植物的第一个KT/HAK/KUP家族基因同年，QuinteroF.J.也从拟南芥中克隆得到了介导高亲和性K+吸收的转运体基因dび。随后，利用T-DNA插入突变体分析方法又从拟南芥中分离出メばび/ (Rigas S., et al. 2001)和AtHAK5 {Gierth M. , et al.，2005)，它们与(Fu. Η. H·, et al. 1998)—样，參与介导高亲和性Rb+(K+)的吸收。目前，从大麦(/MM7，Santa-Maria G. E. et al,1997))、古月椒Martinez-Cordero M.A.，et al. 2004)、冰叶日中花(Su. H·, et al. 2002)、Lotus japonicus (Desbrosses G. , et al. 2004)、葡萄(Davies C·，et al. 2006)、马铃薯(Wang Y. H·, et al. 2002)和浒苔(Garciadeblas B. , et al. 2002)中也陆续克隆出KT/HAK/KUP家族成员。对这些基因的分子结构、功能表达、影响因素以及它们在植物K+吸收过程中所起的作用的研究结果发现，KUP/HAK/KT家族中部分成员參与高亲和性K+转运例如热也优2，0sHAKl,AtHAK5和な胡の，部分成员则主要在毫摩尔K+浓度范围内起作用，參与低亲和性的K+转运；部分成员受低钾胁迫诱导，例如，E.J.，et al.1998)d故优5(Sung, et al. , 2QQA),HvHAKl (Santa-Maria G. E. , et al. 1991), OsHAKl (Banuelos M. A. , et al. 2002)和(Desbrosses G. , et al. 2004)。对于已完成全基因组测序的植物(拟南芥、水稻、杨树)，已经获得其整个KT/HAK/KUP家族成员，其中拟南芥13个，水稻25个，杨树24个，拟南芥和水稻(除0sHAK3外)中所有的KT/HAK/KUP转运体结构都是由10-14个跨膜结构域组成的。KUP/HAK/KT家族中的这些研究成果为进一歩利用生物工程技术改良植物的钾素营养和培育钾高效利用型作物新品种奠定了基础。本研究选取拟南芥高亲和性钾离子转运体基因构建植物表达载体，并用其转化植物，使其在植物中组成型表达，以达到提高植物的钾素影响利用效率以及植物低钾胁迫耐受カ的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种拟南芥钾离子转运体基因的植物表达载体，该载体m-^-AtKUPl能提高植物钾素利用能力，所述载体含有拟南芥钾离子转运体^び基因的cDNA、卡那霉素筛选标记基因Km和组成型启动子CaMV 35S，35S启动子位于メば基因上游。本专利技术所述拟南芥钾离子转运体基因dば基因cDNA来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana'), GenBank 登录号为 AF029876. I。用于构建该植物表达载体的起始载体为pK2GW7(购自Flanders InteruniversityInstitute for Biotechnology, VIBノ 本专利技术另一目的是将该拟南芥钾离子转运体基因メび基因植物表达载体应用在制备具有较高钾素利用率的转基因植物中，转基因植物能高效吸收钾素。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案 I、植物表达载体的构建 (I)从GenBank中查找拟南芥メぱ的编码区基因序列，并设计如下一对引物序列 AtKUP15: 5’ -ggatccatgaaccaatcaccatctctta-3>AtKUP13: 5’ -ctcgagttagac本文档来自技高网...
【技术保护点】
拟南芥钾离子转运体基因AtKUP1植物表达载体pK2？35S？AtKUP1，所述载体含有拟南芥钾离子转运体AtKUP1基因的cDNA、卡那霉素筛选标记基因K2和组成型启动子CaMV？35S。
【技术特征摘要】
1.拟南芥钾离子转运体基因植物表达载体pK2-35S，所述载体含有拟南芥钾离子转运体基因的cDNA、卡那霉素筛选标记基因K2和组成型启动子CaMV35S。2.根据权利要求I所述的植物表达载体，其特征在于拟...
【专利技术属性】
技术研发人员：李昆志，王艺霖，陈丽梅，赵丽伟，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。