本发明专利技术涉及一种转化水稻抗病基因并获得无选择标记转基因后代的方法，首先，将绿色荧光蛋白(GFP)与潮霉素磷酸转移酶(HPT)克隆于标记基因载体，目的基因置于另一T-DNA载体，携带标记基因载体的农杆菌菌株与携带目的基因载体的农杆菌菌株混合并转化水稻愈伤组织，利用特异引物对目的基因载体的抗病基因进行PCR检测，筛选获得共转化植株(T0)。然后，在共转化植株的分离世代(T1或T2)，借助于台灯式荧光检测器，大量、快速地筛除GFP阳性的标记基因植株，并对GFP阴性植株进行抗病基因的PCR检测，从而获得转抗病基因的无选择标记个体。本发明专利技术可以应用于水稻抗稻瘟病基因或其它功能基因的无选择标记转基因育种，提高水稻抗病能力或改良其它农艺性状。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种水稻的转基因技术，尤其是。
技术介绍
培育抗病品种是农作物育种的主要目标之一。转基因技术作为传统育种方法的重要补充，可以避开杂交及多代选择等繁琐过程，将已经从植物基因组克隆的抗病基因转化感病品种，利用较短的时间改良受体品种的抗病性。在水稻抗病基因的育种应用方面，随着水稻基因组学和图位克隆技术的完善，一系列水稻抗病基因被陆续分离和研究，为转基因水稻研究提供了丰富的基因资源。 通过转基因技术培育抗病品种还依赖于高效的无选择标记转化体系。双菌株(双载体)共转化作为一种常用的无选择标记转化方法，具有载体简单和易于构建等优点。与“双T-DNA载体”共转化方法相比较，后者虽然只用单个转化载体，但是单个载体同时含有2个T-DNA区，使得载体构建相对困难一些。如果转化的目的基因为序列较长的水稻NBS-LRR类抗病基因(例如水稻抗稻瘟病基因Pi9)，构建双T-DNA载体的难度会更大。另一方面，现有关于双菌株共转化的研究表明，标记基因载体和目的基因载体发生共转化的频率变化较大，主要受植物材料生理状态和农杆菌转化条件等影响。在转基因分离世代(Tl或T2)，需要分别从大量水稻植株提取DNA和进行标记基因及目的基因的PCR检测。此外，在大约50%共转化植株的基因组中，标记基因和目的基因的T-DNA发生连锁，难于从其后代群体筛选获得分离的无选择标记转基因个体。所以，双菌株共转化后代群体的分析工作非常繁重，亟需提高其无选择标记转基因个体的筛选效率，以便在高效、安全的转基因技术基础上，培育合乎育种目标的农作物新种质。2004年，Kolesnik等在水稻中进行转座因子标签研究，把绿色荧光蛋白(GFP)用作负选择标记，筛除带T-DNA (同时含GFP、HPT标记基因和Ac/Ds转座元件)的水稻分离个体。2005年，Chen等利用一个双T-DNA载体转化烟草，其中标记基因的T-DNA带有GFP和卡那霉素抗性选择标记(NPTII)，目的基因的T-DNA仅含⑶S报告基因。通过GFP荧光检测筛除GFP阳性的Tl植株，再从GFP阴性植株筛选GUS阳性个体，获得了不含NPTII标记的转GUS基因烟草。本专利技术向双菌株共转化载体系统引入了 GFP荧光标记。将GFP与潮霉素磷酸转移酶(HPT)克隆于标记基因载体，目的基因(即水稻抗稻瘟病基因Pi9)置于另一 T-DNA载体，通过双菌株方法获得共转化植株。在分离世代(Tl或T2)筛除GFP阳性的标记基因植株，然后对GFP阴性植株进行Pi9基因的PCR检测，从而获得转Pi9的无选择标记个体。并借助于台灯式荧光检测器，大量、快速地筛除GFP阳性个体，减少后续鉴定Pi9基因的工作量，以提高无选择标记植株的筛选效率。
技术实现思路
本专利技术要解决上述现有技术的缺点，提供一种筛选效率高的转化水稻抗病基因并获得无选择标记转基因后代的方法。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案首先，将绿色荧光蛋白(GFP)与潮霉素磷酸转移酶(HPT)克隆于标记基因载体，目的基因置于另一 T-DNA载体，携带标记基因载体的农杆菌菌株与携带目的基因载体的农杆菌菌株混合并转化水稻愈伤组织，利用特异引物对目的基因载体的抗病基因进行PCR检测，筛选获得共转化植株(TO)。然后，在共转化植株的分离世代(Tl或T2)，借助于台灯式荧光检测器，大量、快速地筛除GFP阳性的标记基因植株，并对GFP阴性植株进行抗病基因的PCR检测，从而获得转抗病基因的无选择标记个体。由于受体水稻的基因组存在与被转化抗病基因同源的序列，所以根据目的基因载体的抗病基因序列及其两侧T-DNA序列，设计了多套PCR引物，分别在T-DNA边界序列与抗病基因上游或下游序列之间进行扩增，对目的基因进行有效检测。专利技术有益的效果是本专利技术向双菌株共转化载体系统引入了 GFP荧光标记将GFP 与潮霉素磷酸转移酶(HPT)克隆于标记基因载体，并借助于台灯式荧光检测器，大量、快速地筛除GFP阳性个体，减少后续鉴定Pi9基因的工作量，以提高无选择标记植株的筛选效率，可以应用于水稻抗稻瘟病基因或其它功能基因的无选择标记转基因育种，提高水稻抗病能力或改良其它农艺性状。附图说明图I:双菌株共转化的载体系统及共转化水稻植株的筛选策略Pi9，水稻Pi9抗稻瘟病基因；GFP，绿色荧光蛋白；HPT，潮霉素磷酸转移酶；LB和RB，T-DNA左边界和右边界序列；图2:从共培养的水稻愈伤组织产生的绿色荧光转化细胞团A :经过3d农杆菌共培养和l(Tl5d潮霉素培养基上的选择培养，在灯式荧光检测器下多个愈伤组织产生GPT+转化细胞团；B :从单个愈伤组织产生的GFP+转化细胞团；图3 :共转化水稻植株中Pi9抗稻瘟病基因的PCR检测A pLJ42载体T-DNA区的DNA序列以及Pi9基因的PCR引物。RB和LB序列用黑体字母表示，RB和LB附近序列的特异引物(RB-1、RB-2、LB-1和LB-2)的同源序列用下划线表示，Pi9两侧的SalI酶切位点用斜体字母表示。Pi9-l、Pi9-2和Pi9-3，Pi9基因的特异引物。引物的扩增方向用箭头表示。B和C :分别为RB-I和Pi9-1引物的PCR(Pi9/RB-PCR)、以及LB-I和Pi9-2弓丨物的PCR(Pi9/LB-PCR)。M，DNA分子量标准；1，负对照(水);2，正对照(pLJ42质粒);3，负对照(未转化水稻);4-11，日本晴的8个独立转化植株(TO)。D :空育131、浙11B、粤泰B和浙恢414的TO植株的Pi9/RB-PCR和Pi9/LB_PCR分析。MjDNA分子量标准；1-2 (空育 131) ;3-6(浙 11B) ;7(粤泰 B) ;8_12(浙恢 414)；图4浙粳22T1代植株Pi9、HPT和GFP基因的PCR分析浙粳22 :水稻转化受体；WX207和WX208 :独立转化的共转化水稻株系；Pi9+HPT-GFP-:转Pi9的无选择标记Tl代植株；图5浙恢414和浙粳22的共转化Tl代植株稻瘟菌接种鉴定A :菲律宾稻瘟病菌系P06-6的接种结果，无选择标记的Pi9基因植株表现抗病，而转化受体浙恢414和不含Pi9的Tl植株均表现感病；B :浙江省12个稻瘟病菌系(B1、B15、C13、D1-1、D1-2、D3-1、D3-2、D3-3、D7-1、D7-2、E1 和 E3)混合孢子的接种结果，转 Pi9 基因的无选择标记植株表现抗病，而浙粳22和不含Pi9的Tl植株表现感病。原丰早、Co39和丽江黑谷感病品种；浙恢414和浙粳22 :水稻转化受体；75-1-127 :含Pi9抗稻瘟病基因的水稻品系；WX409 :浙恢414的I个共转化株系；WX207 :浙粳22的I个共转化株系。具体实施例方式下面结合附图对本专利技术作进一步说明实施例以转化水稻广谱抗稻瘟病基因Pi9为例，通过改进的双菌株(双载体)共转化系统，创制转抗病基因的无选择标记水稻种质材料。载体构建共转化载体系统包括标记基因载体(pRBOl)和目的基因载体(pLJ42)，如图I。将玉米泛素启动子Ubi控制的绿色荧光蛋白(GFP)基因克隆到农杆菌转化载体pCAMBIAl300 (Genbank AF234296)的HindIII和EcoRI酶切位点，产生标记基因载体 p本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种转化水稻抗病基因并获得无选择标记转基因后代的方法，包含以下步骤1)将绿色荧光蛋白(GFP)与潮霉素磷酸转移酶(HPT)克隆于标记基因载体，目的基因置于另一T-DNA载体；2)携带标记基因载体的农杆菌菌株与携带目的基因载体的农杆菌菌株混合并转化水稻愈伤组织；3)利用特异引物对目的基因载体的抗病基因进行PCR检测，筛选获得共转化植株(TO) ;4)在共转化植株的分离世代(Tl或T2)，借助于台灯式荧光检测器，筛除GFP阳性的标记基因植株，并对GFP阴性植株进行抗病基因的PCR检测，从而获得转抗病基因的无选择标记个体。2.根据权利要求I所述的转化水稻抗病基因并获得无选择标记转基因后代的方法，其特征是所述步骤I)具体地说，将玉米泛素启动子Ubi控制的绿色荧光蛋白(GFP)基因克隆到农杆菌转化载体PCAMBIA1300 (Genbank AF234296)的HindIII和EcoRI酶切位点，产生标记基因载体pRB01，pRB01还携带由花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子控制的潮霉素磷酸转移酶基因(HPT);将 pCAMBIA0380 载体(Genbank AF234290) T-DNA 区的 Nos-polyA 序列去除，获得T-DNA区不含任何基因的衍生载体pZJ06，然后将水稻广谱抗稻瘟病基因Pi9的基因组片段(13. 5kb)克隆到pZJ06载体的SalI位点，产生目的基因载体pLJ42。3.根据权利要求I所述的转化水稻抗病基因并获得无选择标记转基因后代的方法，其特征是所述步骤2)具体地说，携带目的基因载体PLJ42的农杆菌与携带标记基因载体PRBOl的农杆菌菌液混合，每个水稻品种(系)取IOOlOO块愈伤组织，在IOml农杆菌混合液中浸泡IOmin ;吸去菌液，将愈伤组织转移到灭菌滤纸上，超净工作台上干燥15min ;再将愈伤组织转移到表面覆盖有无菌滤纸的共培养培养基，20°C黑暗条件下培养3d ;经过共培养的愈伤组织，先用无菌水洗4-5次，再用含300mg/L羧苄青霉素的无菌水溶液洗1_2次，30min ;用无菌滤纸吸干愈伤组织表面水份，将愈伤组织转移到选择培养基(NB，50mg/L潮霉素，300mg/L头孢霉素)，经过15 20d的第一次选择培养，筛选表达GFP绿色荧光的转化愈伤组织，并转移到新鲜的选择培养基，进行第二次选择培养，持续15-20d ；GFP阳性愈伤组织在分化培养基(NB，3mg/L 6-BA,0. 5mg/L NAA)上培养25 30d，待分化苗长到4cm左右时转移到生根培养基(1/2NB，无激素)诱导生根。4.根据权利要求3所述的转化水稻抗病基因并获得无选择标记转基因后代的方法，其特征是所述水稻品种(系)包括浙恢414、浙粳22、浙11B、日本晴、空育131和粤泰B。5.根据权利要求3所述的转化水稻抗病基因并获得无选择标记转基因后代的方法，其特征是所述农杆菌混合液的培养具体地说，取转化载体PRBOl和pLJ42的农杆菌单菌落，在含50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中单独培养(28°C，200r/min, l_2d)，在菌液0D600值达到I. ri. 8时，向OD值较高的菌液加...
【专利技术属性】
技术研发人员：瞿绍洪，李军，王歆，赵建华，何海燕，刘中来，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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