在非竞争性免疫测定中减少白细胞干扰制造技术

本发明专利技术涉及用于在分析物免疫测定、尤其是非竞争性免疫测定中减少来自白细胞的干扰的方法和设备。在一个实施方案中，本发明专利技术是包括如下步骤的方法：(a)用消耗珠子修正生物样品例如全血样品；和(b)对修正的样品进行竞争性免疫测定以测定所述分析物在所述样品中的浓度。优选，用IgG-涂覆的消耗珠子修正样品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在用于利用非竞争性免疫测定法测定分析物在血液样品中的存在或浓度的装置和方法中减少或消除来自血沉棕黄层(buffy coat)组分、特别是白细胞的干扰。具体地，本专利技术涉及通过用受调理素作用的消耗珠(sacrificial bead)和类似地受调理素作用的组件修正(amend)血液样品来减少或消除白细胞免疫传感器干扰。
技术介绍
为了诊断、筛选、疾病分期、法医分析、妊娠测试、药物检测以及其它原因，会对生物样品进行许多目标分析物的实验室免疫测定测试。虽然少数定量测试例如妊娠测试已被简化成用于患者在家中使用的简单试剂盒，但大部分定量测试仍然需要经训练的专业技术人员在实验室环境中使用复杂仪器进行。实验室测试增加了分析成本并且延迟了结果。在许多情况下，延迟可能对患者的病况或预后(例如表示心肌梗塞和心力衰竭的标志物的分析)有害。在此类和类似危急情况下，有利地是在及时现场护理(point-of-care)时准确、便宜地并且以最短延迟进行此类分析。许多类型的免疫测定装置和方法已进行了描述。一种用于成功地测量血液样品中的分析物的一次性传感设备由Lauks在美国专利No. 5，096, 669中公开。其它设备由Davis等人在关于凝血时间的美国专利No. 5，628，961和5，447，440中公开。这些设备使用读数装置和适合读数装置的筒(cartridge)以测量作为时间函数的血液样品中分析物的浓度和粘度的改变。将美国专利Nos. 5，096，669,5, 628，961和5，447，440通过引用整体并入本文。US 20060160164描述了利用免疫参考电极的免疫测定设备，US 20050054078描述了利用改进的样品封闭(sampleclosure)的免疫测定设备，US 20040018577描述了多重杂交免疫测定(multiple hybrid immunoassay), US 20030170881 (授权为 US 7，419，821)描述了用于分析物测量和免疫测定的装置和方法，全部所述专利是共同拥有的并且通过引用并入本文。非竞争性两位点免疫测定法(Non-competitivetwo-site immunoassay)(也称为夹心型免疫测定法)通常用于测定生物测试样品中的分析物浓度，用于例如由AbbottPoint of Care Inc.开发为i-Stat 系统的及时现场分析物检测系统。在典型的两位点酶联免疫吸附测定(ELISA)中，将一种抗体结合至固体载体上以形成固定或捕捉抗体，并且将第二种抗体缀合至或结合至信号产生性试剂例如酶以形成信号或标记抗体。在与包含待测量的分析物的样品反应后，分析物被“夹”在固定抗体与信号抗体之间。在清洗掉样品和任何非特异性结合的试剂后，测量保留在固体载体上的信号抗体的量，该量应当与样品中的分析物的量成比例。电化学检测也已被用于免疫测定，在所述电化学检测中分析物的结合直接或间接引起与电极相邻的电活性物质种类的活性改变。关于电化学免疫测定的综述，参见Laurell等人，Methods in Enzymology,第 73 卷，〃Electroimmunoassay〃，Academic Press, NewYork, 339，340, 346-348(1981)。在电化学免疫传感器中，分析物与其同源抗体的结合产生了电极上的电活性物质种类的活性改变，所述电极处于适当的电化学电势下以引起电活性物质种类的氧化或还源。存在许多用于满足这些条件的设置。例如，可将电活性物质种类直接附着至分析物，或可将抗体共价地连接至从无电活性底物产生电活性物质种类或破坏电活性底物的酶。参见，M. J. Green(1987)Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 316 :135-142。差分安培测量(differentialamperometrie measurement)的概念在电化学领域是公知的。参见，例如，共同拥有的Cozzette美国专利No. 5，112，455，通过引用整体并入本文。此外，差分安培传感器组合的形式公开于共同拥有的Cozzette美国专利No. 5，063，081。该专利还公开了选择性渗透层用于电化学传感器的用途以及成膜乳胶用于固定生物活性分子的用途，通过引用并入本文。聚(乙烯醇)(PVA)在传感器制造中的用途描述于美国专利No. 6，030，827 (通过引用并入本文)。Vikholm (U. S. 2003/0059954A1)教 导了直接连接至具有生物分子排斥涂层例如PVA的表面、抗体之间空隙中的表面的抗体，Johansson (美国专利No. 5，656，504)教导了具有固定在其上的抗体的固相例如PVA。美国专利No. 6，030, 827和6，379，883教导了用于形成聚(乙烯醇)层的方法，所述专利通过引用整体并入本文。如在本领域内是公知的，免疫测定易遭受各种形式的干扰。例如共同拥有的在审的美国申请12/411，325阐述了通过将IgM包括在IgG试剂混合物中来减小嗜异性抗体的干扰。将‘325申请通过引用整体并入本文。随着免疫测定技术不断地被改造以适合进入及时现场护理测试市场，将全血用作测试介质相对于血浆和血清已得到增加，血浆和血清通常用于中心实验室测试。这显然意味着红细胞和血沉棕黄层成分(例如白细胞和血小板)存在于测定介质中。已发现在某些测定中，可针对白细胞有效地对不同的测定组分例如珠子和电极表面进行调理作用。注意，对于电极表面，为了基于超氧离子的电化学检测而观察人嗜中性粒细胞的呼吸爆发，Hill 等人(FEBS 191，257-263，1985)利用人 IgG 对微伏安电极(microvoltammetricelectrode)进行调理作用。先前提及的US 20060160164( ‘ 164申请)论述了电化学免疫传感器和全血与血浆之间的偏差(bias);以及，标志物例如肌钙蛋白等的免疫测定通常被测量和报告为血浆或血清值。其提及当将这些免疫传感器用于分析全血时，需要使用用于消除偏差的校正因子或方法。其说明该偏差的某些方面可被消除，包括与血沉棕黄层(其由白细胞和血小板组成)的组分相关的全血电化学免疫测定中的偏差，以及还有与样品之间的血细胞比容(hematocrit)差异相关的偏差。本领域技术人员公认血沉棕黄层是当将血液离心时在红细胞上方形成的一层白细胞和血小板。在‘164申请中，还观察到在具有涂覆了分析物抗体例如肌钙蛋白抗体的珠子的免疫传感器上发生白细胞干扰。对照实验显示该正偏差不存在于血浆样品和其中已除去血沉棕黄层的血液样品中。因此，白细胞似乎能够粘附至免疫传感器并且促进酶标记的抗体的非特异性结合，所述抗体甚至在洗涤步骤后仍然保持结合。在该公开内容中显示该偏差可通过在珠子制备过程中将少量抗体添加至人血清白蛋白来部分消除。因此，当样品与修饰的珠子接触时，来自样品的白蛋白快速包被珠子，并且一旦它们被一层天然白蛋白包被，白细胞就不应当将珠子识别为受调理作用的表面。‘164申请还描述了对白细胞干扰问题的另一个解决方法，其中通过使血液样品的盐浓度从约140mM的正常钠离子浓度增加至高于约200mM，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.11.17 US 12/620,1791.一种用于对怀疑存在于血液样品中的分析物进行夹心式免疫测定的试剂盒，包括针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子，针对分析物的固定的第一抗体和针对分析物的标记的第二抗体。2.权利要求I的试剂盒，其中所述分析物选自BNP、proBNP、NTproBNP、cTnI、TnT、HCG、TSH、PSA、D- 二聚体、CRP、肌红蛋白、NGAL, CKMB和髓过氧化物酶。3.权利要求I的试剂盒，其中所述消耗珠子包括用非人IgG或其片段涂覆的基底珠子。4.权利要求3的试剂盒，其中所述基底珠子由选自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成。5.权利要求I的试剂盒，其中所述消耗珠子包括利用选自蛋白质、细菌、病毒和异型生物质的材料或其片段涂覆的基底珠子。6.权利要求I的试剂盒，其中所述消耗珠子是经稳定的细菌或细菌孢子。7.权利要求I的试剂盒，其中所述消耗珠子具有O.01 μ m至20 μ m的平均粒度。8.权利要求I的试剂盒，其中所述消耗珠子具有O.I μ m至5 μ m的平均粒度。9.权利要求I的试剂盒，其中所述消耗珠子以足以提供每微升样品至少IO4个珠子的溶解的消耗珠子浓度的量存在。10.权利要求I的试剂盒，其中所述固定的第一抗体附着至传感器，所述传感器选自安培计电极、电位测定电极、电导测定电极、光波导、表面等离子体共振传感器、声波传感器和压电式传感器。11.权利要求I的试剂盒，其中固定的第一抗体附着至测定珠子，并且测定珠子附着至安培计电极。12.权利要求I的试剂盒，其中所述消耗珠子和第二标记的抗体在一种或多种可溶解的干试剂涂层中。13.权利要求I的试剂盒，其中所述标记的第二抗体用选自放射性标记物、酶、生色团、荧光团和化学发光物质种类的标记物进行标记。14.权利要求I的试剂盒，其中所述标记的第二抗体用选自碱性磷酸酶、葡萄糖苷酶、黄递酶、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的酶标记。15.一种用于对怀疑存在于血液样品中的分析物进行夹心式免疫测定的筒，所述筒包括 (a)接收血液样品的样品入口； (b)用于计量血液样品以形成计量样品的计量室； (C) 一个或多个包含针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子和针对分析物的标记的抗体的干试剂涂层； (d)包含针对分析物的固定抗体的电极；和 (e)用于将计量样品、流态化的消耗珠子和标记的抗体移至电极的一个或多个泵件。16.权利要求15的筒，其中所述分析物选自BNP、proBNP、NTproBNP,cTnl、TnT, HCG,TSH、PSA、D- 二聚体、CRP、肌红蛋白、NGAL, CKMB和髓过氧化物酶。17.权利要求15的筒，其中所述消耗珠子包括用非人IgG或其片段涂覆的基底珠子。18.权利要求17的筒，其中所述基底珠子由选自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成。19.权利要求15的筒，其中所述消耗珠子有O.Ol μ m至20 μ m的平均粒度。20.权利要求15的筒，其中所述消耗珠子以足以提供每微升样品至少IO4个珠子的溶解的消耗珠子浓度的量存在。21.权利要求15的筒，其中一个或多个干试剂涂层沉积在计量室内。22.—种对怀疑存在于血液样品中的分析物进行夹心式免疫测定的方法，包括 (a)将怀疑含有分析物的血液样品暴露于针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子、针对分析物的固定的第一抗体、和标记的第二抗体以形成包含所述第一抗体、所述分析物和所...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·L·E·坎贝尔，A·R·摩丝，G·戴维斯，
申请(专利权)人：雅培医护站股份有限公司，
类型：发明
国别省市：