本发明专利技术公开了一种直接检测IL-6的电化学免疫传感器及应用，所述传感器以单壁碳纳米管为基底，将金纳米粒子沉积于单壁碳纳米管上构成单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极，杂化电极用巯基乙酸修饰，再在巯基乙酸上组装IL-6捕获抗体，再用质量浓度1～5％牛血清蛋白的PBS缓冲液封闭，获得所述电化学免疫传感器；本发明专利技术的电化学免疫传感器具有制备过程简便、无需标记或夹心处理、成本低廉、检测灵敏度高等优点，可广泛用于各种免疫分析和检测，且本发明专利技术制备的电化学免疫传感器对目标IL-6抗原的检测限可达到1×10-17g/ml。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种免疫传感器，特别涉及一种直接检测IL-6的电化学免疫传感器及制备方法和检测应用。
技术介绍
白细胞介素6(IL_6)可由淋巴细胞或非淋巴细胞产生，是一种多功能细胞因子，不仅在机体免疫应答、急相反应和造血控制中起重要作用，而且其失调产生与多种临场疾病和炎症反应密切相关，如牛皮癣，风湿性关节炎，心血管疾病和炎性肠病。此外，其过高表达与几种典型癌症相关，如头颈部鳞癌(HNSCC)、结肠癌、胃肠癌。然而白细胞介素6在正常人体内浓度(6pg/ml)非常低，因此，对低浓度IL-6的检测是该领域的一大挑战。生物医学上关于白细胞介素6的常规临床免疫分析方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法等。其中，放射免疫分析法灵敏度高，干扰少，应用范围宽，但实际寿命有限，并且其放射性标记物对人体有害；酶联免疫分析法、荧光和化学发光免疫分析法在很大程度上促进了临床免疫分析手段的自动化、智能化和网络化，但这些方法需要价格昂贵的专用仪器设备，操作复杂，成本高，难以推广使用。因此研发一种廉价、简便且适用于现场直接定量的免疫测定技术极为重要。免疫传感器检测技术是将免疫检测技术与传感检测技术相结合而形成的一类新型检测技术，是生物传感器领域发展最迅速的技术之一，具有灵敏度高、特异性强、检测快速、使用简便、低成本等许多有点。传统的免疫传感器测定技术分为两类竞争测定和夹层测定。在竞争测定中，试样中的抗原与抗原-探针复合物(通常称作报道复合物)进行混合，然后，混合物中的抗原通过竞争与抗体结合。探针可以是放射性同位素、酶、荧光团。在夹层免疫测定技术中，试样中的抗原与抗体结合，然后第二抗体-探针复合物与抗原结合。但上述方法需要对目标抗原进行处理，操作过程复杂并且耗费抗体。本专利技术通过在现场生长的碳纳米管上电沉积金纳米粒子作为工作电极，再在金纳米粒子上自组装上巯基乙酸分子层来固定anti-IL-6抗体，发展成一种高灵敏度、高特异性免疫传感器，可以快速直接检测液体试样中目标抗原的浓度。碳纳米管(CNTs)是一种具有一维纳米管状结构的新型纳米材料，它独特的电子特性和表面结构，能很好地促进生物电活性分子的电子传递，并易于固定生物大分子并能保持其活性。纳米金颗粒具有比表面积大、生物亲和性高等优点，并具有导电作用和加快蛋白质与电极之间的直接电子转移，适合于构建无需电子媒介物质的直接电化学生物传感器。目前，碳纳米管和纳米金作为电活性材料及载体已被广泛应用于电化学和生物传感器中，爱尔兰国立大学的Rusling教授的研究小组(Anal. Chem. 2010，82，3118)报道在高表面积、高传导性的垂直碳纳米管上固定anti-IL-6捕获抗体，捕获抗体附着在碳纳米管末端，再与样本中的IL-6目标抗原结合，接着一个被酶标记的第二抗体耦合物再与传感器上的目标抗原结合，通过电化学方法检测酶标记物的信号。另外，山东省氟化学和化工化学重点实验室的魏琴教授课题组(Biosens. Bioelectron. 2011, 26, 3714)利用纳米金大的比表面积和好的生物相容性等优点，在纳米金上固定生物分子，通过对铁氰化钾的电子转移响应电流信号来监控。但鲜有在现场生长的碳纳米管上直接电沉积纳米金粒子构建电化学免疫传感器。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种简单、廉价、高灵敏度且可以现场直接检测的电化学免疫传感器，提供所述IL-6免疫电化学传感器的制备方法以及检测应用，本专利技术电化学传感器以单壁碳纳米管为基底，将金纳米粒子沉积于单壁碳纳米管上构成单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极，杂化电极用巯基乙酸修饰，再在巯基乙酸上组装IL-6捕获抗体。本专利技术采用的技术方案是一种直接检测IL-6的电化学免疫传感器，所述传感器按下述方法制备(I)单壁碳纳米管以硅片或石英片为基底，以Fe/Mo纳米粒子为催化剂，以乙醇作碳源，以200ml/ min流速的氢气作为载气和保护气，将碳源带入，于石英管中1000°C下反应15min，获得单壁碳纳米管；所述Fe/Mo催化剂通过在辛基醚中热分解Fe (CO)6和Mo (CO)6获得(参见Chem. Mater. 2001，13，1008-1014);所述Fe/Mo纳米粒子中Fe和Mo物质的量之比为5 I ；(2)单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极将单壁碳纳米管用铜丝连接作为工作电极，以钼作为对电极，以摩尔浓度O. I IOmMHAuCl4水溶液(优选ImM的HAuCl4水溶液)为电解液，在电压为-O. IV -O. 5V下进行电化学沉积5 50s，获得单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极；(3)单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极的修饰将单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极浸泡在I IOmM (优选5mM)的SHCH2C00H水溶液中，室温下浸泡3 IOh (优选5h)，取出，用水清洗，得清洗后的电极置于EDC/NHS混合水溶液中，室温下浸泡10 30min(优选IOmin)，取出用水清洗后，获得修饰后的单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极；所述EDC/NHS混合水溶液为I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液；(4)电化学免疫传感器将步骤(3)获得的修饰后的单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极浸泡在10 100 μ g/ml (优选10 μ g/ml)的IL-6捕获抗体的PBS缓冲液(pH =7. 2)中，室温(25°C )下浸泡2 8h (优选5h)，取出，用Tween-20水溶液和PBS缓冲液交替清洗，获得结合抗体的杂化电极，然后再将结合抗体的杂化电极浸泡在质量浓度I 5%(优选2 % )牛血清蛋白的PBS缓冲液(pH = 7. 2)中，室温下浸泡O. 5 2h (优选Ih)进行封闭，取出，用Tween-20水溶液和PBS缓冲液交替清洗，风干，获得所述的电化学免疫传感器。步骤(I)所述方法优选为将硅基片浸入Fe/Mo纳米粒子的庚烷溶液(Fe/Mo纳米粒子的量以Fe物质的量计，5mmol/L)，IOs后取出，晾干，转移至石英管中，然后用加热炉将石英管升温到1000°C，以乙醇作碳源，以200ml/min流速的氢气作为碳源的载气和保护气，将乙醇蒸汽(碳源)带入石英管中，1000°C下反应15min，在硅基片上获得单壁碳纳米管(SffCNTs)。步骤(I)所述单壁碳纳米管为水平平行排列的阵列结构，阵列密度控制在每100 μ M区间有4 50根单壁碳纳米管，每根单壁碳纳米管的长度位于100 μ m 2mm之间。步骤(2)所述单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极上的金纳米粒子为多级结构的金枝晶，所述金纳米粒子的负载量与沉积时间，电压和含金溶液的浓度有关，本专利技术中金纳米粒子的沉积条件需控制在所述的沉积时间、电压、含金溶液的浓度范围内。步骤(2)所述电压优选为-O. 5V下进行电化学沉积8 15s，更优选10s。步骤(3)所述EDC/NHS混合水溶液为1_乙基_3_ (3_ 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与水混合，使I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺终浓度为400mM, N-羟基琥珀酰亚胺终浓度为lOOmM。 步骤(4)所述用Tween-20水溶液和PBS缓冲液交替清洗的方法本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种直接检测IL-6的电化学免疫传感器，其特征在于所述传感器按下述方法制备(I)单壁碳纳米管以硅片或石英片为基底，以Fe/Mo纳米粒子为催化剂，以乙醇作碳源，以氢气作为碳源的载气和保护气，于石英管中1000°C下反应15min，获得单壁碳纳米管；所述Fe/Mo纳米粒子中Fe和Mo物质的量之比为5 I ； (2)单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极将单壁碳纳米管用铜丝连接作为工作电极，以钼作为对电极，以摩尔浓度0. I IOmMHAuCl4水溶液为电解液，在电压为-0. IV -0. 5V下进行电化学沉积5 50s，获得单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极；(3)单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极的修饰将单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极浸泡在I IOmM的SHCH2C00H水溶液中，室温下浸泡3 10h，取出，用水清洗，得清洗后的电极置于EDC/NHS混合水溶液中，室温下浸泡10 30min，取出用水清洗后，获得修饰后的单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极；所述EDC/NHS混合水溶液为I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液；(4)电化学免疫传感器将步骤(3)获得的修饰后的单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极浸泡在10 100 u g/ml的IL-6捕获抗体的PBS缓冲液中，室温下浸泡2 8h，取出，用Tween-20水溶液和PBS缓冲液交替清洗，获得结合抗体的杂化电极，然后再将结合抗体的杂化电极浸泡在质量浓度I 5%牛血清蛋白的PBS缓冲液中，室温下浸泡0. 5 2h进行封闭，取出，用Tween-20水溶液和PBS缓冲液交替清洗，风干，获得所述的电化学免疫传感器。2.如权利要求I所述的直接检测IL-6的电化学免疫传感器，其特征在于步骤(3)所述EDC/NHS混合水溶液为I-乙基-3- (3- 二甲...
【专利技术属性】
技术研发人员：王舜，陈锡安，金辉乐，杨婷，
申请(专利权)人：温州大学，
类型：发明
国别省市：
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