本发明专利技术公开了一种转基因大豆RoundupReady（GTS40-3-2）及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。坚持引物组包括四条特异性引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照；试剂盒还可以有显色剂。其检测方法是通过提取待检大豆品种的DNA、采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到109～1010个拷贝，其鉴定采用加入SYBRGreenI观察颜色变化或者利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化判断扩增与否，确定待检大豆品种是否含有或为转基因大豆RoundupReady（GTS40-3-2）及其衍生品种。本发明专利技术具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学
，涉及转基因植物品种的检测方法，具体涉及转基因大豆Roundup Ready (GTS 40_3_2)及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
国际农业生物技术应用服务组织近期发表的《2010年全球生物技木/转基因作物商业化发展态势》报告显示，由于转基因作物带来的巨大益处，过去15年内大约有I亿人次的农民做出种植决定。自转基因作物投入商业化种植15年来,全球转基因作物种植面积累计已经超过10亿公顷。2010年,全球29个国家的1540万农民种植了共I. 48亿公顷的转基因作物。自1996年至2010年，全球转基因作物的种植面积增加了 87倍。种植转基因作物排名前十位的国家种植面积首次均超过了 100万公顷。这些国家按照作物种植面积的大小排列分别是美国(6680万公顷)、巴西(2540万公顷)、阿根廷(2290万公顷)、印度(940万公顷)、加拿大(880万公顷)、中国(350万公顷)、巴拉圭(260万公顷)、巴基斯坦(240万公顷)、南非(220万公顷)和乌拉圭(110万公顷)。目前，世界各国已进行田间试验的转基因作物超过5000种，批准商品化的转基因作物有160多种，包括玉米、大豆、油菜、番茄、马铃薯、甜椒、木瓜、甜菜、烟草、水稻等。欠豆{Glycine ffiar)是ー种其种子含有丰富的蛋白质的豆科植物,原产国为中国，至今已有5000年的种植史。1996年以来中国开始大量进ロ大豆，进ロ量相当于我国的大豆产量。中国进ロ的大豆主要来自美国、阿根廷和巴西。这三个国家均为转基因大豆种植大国。其中，从美国进ロ的转基因大豆就占进ロ总量的89%。美国的转基因大豆主要是孟山都公司生产的抗草甘膦转基因大豆(Roundup Ready)ο大豆品系Roundup Ready (GTS40-3-2)是由加拿大孟山都公司(Monsanto)开发的,它使得在大豆种植中，可以选用草甘膦作除草剤。GTS 40-3-2的发展是以DNA重组技术为基础，引入抗草甘膦的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-憐酸合酶(EPSPS)基因，该基因是从Agrobacterium tumefaciens strainCP4分离出来的,转入商业大豆品种“A5403”中(ASgrow种子公司)。生物多样性指在一定范围内各种有机体(植物、动物、微生物)的总和，包括遗传多祥性，生态系统多祥性，物种多样性和景观多祥性4个方面。理论上讲，转基因生物具有普通物种不具备的优势特征，若释放到环境，有可能改变物种间的竞争关系，破坏原有自然生态平衡，导致生物多祥性的丧失。由于我国转基因大豆还没有进入大面积种植和商业化，关于其对生物多样性现实和潜在的影响的研究不多。但是已经有研究表明，Roundup Ready大豆能够和原产中国的野生大豆品种G. soja和P. soja杂交，虽然此实验结果对于转基因大豆对中国生物多祥性的影响还没有定论，但考虑到在中国，大豆属于原产作物，品种多，如果通过传粉进行基因转移，可能将ー些抗虫、抗病、抗除草剂或对环境胁迫具有耐性的基因转移给野生亲缘大豆，对中国大豆品种多样性存在巨大的潜在危险。可以说，墨西哥玉米品种受基因污染，是中国大豆的前车之鉴。因此，转基因大豆可能带来的环境风险和食品安全性问题值得我们投以更多的重视。1993年，联合国经济发展与合作组织(OECO)提出了食品安全性评估的“实质等同性”原则。如果准基因作物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。最早提出对转基因食品进行标识管理的是欧盟，1998年，欧盟在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明；1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1%的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到O. 9%。日本，澳大利亚，新西兰对转基因成分的最低含量做了不同規定，域值从I 5%不等。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年I月5日公布了农业转基因生物安全评价，标识和进ロ安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。为了能够对转基因作物及其产品做出综合评价，除了需要各国政府和国际机构制定科学的安全评价体系以及严格的管理法规外，建立有效的方法体系对转基因作物进行检测也很重要，这是对转基因作物进行安全性评价和实施监管的基础，也是农产品国际贸易健康发展的重要保障。转基因产品的检测要求方法要快速，准确，灵敏，并且还得考虑适应大样品量，目标基因种类多等特点。因此，目前转基因作物的检测主要是检测样品是否含有外源蛋白质(基因表达产物)和是否含有外源基因(DNA)。转基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫原理的酶联免疫吸附法(ELISA)试纸条检测、Western杂交等方法检测，主要从待测样品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基质，利用与目的蛋白(抗原)特异性结合的特性，通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号，但是这种方法要求高质量高稳定性的抗体，否则因准确性不够，只能作为辅助检测手段。转基因作物的核酸检测方法主要有两种核酸分子杂交技术(Sourthernblot) ,PCR检测技术。其中PCR检测方法是最主要,最准确地检测转基因作物的方法，包括定性PCR方法，符合PCR方法，巢式PCR方法，竞争性定量PCR方法，荧光定量PCR方法等等。目前，国内外推广使用的是定性PCR和实时定量PCR检测方法PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。通过聚合酶的作用，在体外快速特异地扩增目的片段，使微量、特定目的DNA片段在几小时内迅速扩增到百万倍，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化こ锭染色后很容易观察，因而具有快速灵敏等优点。然而，PCR方法反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；所需PCR仪价格在5万元左右，扩增时间2 3小时，扩增结果的电泳时间需要I小时左右；电泳常用染料EB为强致癌物质，有较强毒性，且难以实行现场检測。所以，在科学研究和生产实践中均需要ー种快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的转基因作物检测方法。 环介导等温基因扩增技术(Loop-MediatedIsothermal Amplification,以下简称LAMP法)是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技木，其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将LAMP法应用于快速检测转基因大豆Roundup Ready (GTS 40_3_2)及其衍生品种的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的ー个目的在于提供ー种转基因大豆Roundup Ready (GTS 40_3_2)及其衍生品种的LAMP检测引物组。本专利技术的另ー个目的在于提供ー种转基因大豆Roundup Ready (GTS 40_3_2)及其衍生品种的LAMP检测试剂盒。本专利技术的另ー个目的在于提供一种基于上述检查引物组与检测试剂盒的转基因大豆Roundup Ready (GTS 40_3_2)及其衍生品种的恒温基因扩增检测方法。 本专利技术所采用的技术方案如下 转基因大豆Roundup Ready本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
2012.01.19 CN 201210017350.X1.转基因大豆RoundupReady (GTS 40_3_2)及其衍生品种的LAMP检测引物组，包括外引物I、外引物2、内引物I和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示外引物 I :GCTTCAACATGTGAAGGAGTA (SEQ ID No 1)；外引物 2 AACTACCTTCTCACCGCA (SEQ ID No 2)；内引物 I :CAACGAGAAGCTATATGTAGATGCTCACTCACCAGTGACCCTA (SEQ ID No :3);内引物 2 :CAAAACTATTTGGGATCGGAGAAGAGAACTTCTCGACGATGGC (SEQ ID No :4)。2.转基因大豆RoundupReady (GTS 40_3_2)及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，包括以下成分 Cl)引物液含有权利要求I所述的引物组，浓度分别为4 6μΜ外引物1、4 6μΜ外引物2，32 48 μ M内引物1、32 48 μ M内引物2 ; (2)反应液含有IOmMdNTPUOXThermoPol反应缓冲液、150mM MgS04水溶液，三者的体积比是7 9 :4 6 :2 ; (3)DNA聚合酶浓度为7 9υ/μ I ; (4)对照阳性对照为转基因大豆RoundupReady (GTS 40-3-2)的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。3.根据权利要求2所述的转基因大豆RoundupReady (GTS 40_3_2)及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述引物液中含有5μ M外引物1、5リ11外引物2，4(^皿内引物1、40μΜ内引物2。4.根据权利要求2所述的转基因大豆RoundupReady (GTS 40_3_2)及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/ μ I。5.根据权利要求2所述的转基因大豆RoundupReady (GTS 40_3_...
【专利技术属性】
技术研发人员：常彦磊，李志勇，凌莉，杨坚，肖艳文，石磊，
申请(专利权)人：广州迪澳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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