本发明专利技术涉及一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，由于通过驱动电路驱动聚合物分散液晶同轴透镜阵列，来控制焦点的位置，从而实现斩波，通过控制施加在不同液晶盒上的电压，可以达到单点控制的效果，同时还具有横向分辨率、纵向分辨率、时间分辨率高等特点，由于控制的是N×N式透镜阵列，可以实现多点并行实时探测。在荧光共焦探测和生物方面有诸多应用，如可对活体细胞进行实时观测，获取活细胞内的信息，并对所获得的信息进行定量分析，比目前一般的共焦显微探测系统更加便捷、高效。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种显微成像技术，特别涉及。
技术介绍
共焦显微技术最初的主要目的是消除普通光学显微镜在探测样品时产生的多种散射光。激光扫描共聚焦显微镜是一种先进的分子生物学和细胞生物学研究仪器。它在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，结合数据化图像处理技术，采集组织和细胞内荧光标记图像，在亚细胞水平观察钙等离子水平的变化，并结合电生理等技术观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系。激光扫描共聚焦显微镜对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好的会聚，可以全部通过针孔被探测器接收。而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑，对比针孔的直径大小，则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。而且随着距离物镜焦平面的距离越大，样品所产生的杂散光在针孔处的弥散斑就越大， 能透过针孔的能量就越少，因而在探测器上产生的信号就越小，影响也越小。由于它的应用范围较广泛，已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学和药理学等研究领域中很重要的研究技术。共焦显微镜从产生至今获得了巨大的发展，扫描方式从最初的狭缝扫描方式(扫描速度较快，图像分辨率不高)，到阶梯式扫描技术(提高了图像分辨率，标本制备要求太高)，再到驱动式光束扫描器(扫描速度较快，符合共聚焦原理)，又出现使用光子晶体光纤产生的超白光作激励光源的彩色共焦显微镜、三维数字共焦拉曼显微镜以及光纤耦合多路复用共焦显微镜等新型共焦显微镜。频分复用荧光共焦显微成像的概念和构想诞生于2006 年，当时只能通过马赫曾德光路和机械斩波器实现双路频分复用荧光共焦系统，系统的体积很大。为了真正实现多路频分复用系统，专利技术人曾提出采用离轴全息透镜阵列实现多路频分复用荧光共焦成像系统，但是由于离轴系统对角度要求很高，造成了系统实现的麻烦。 为此，我们又提出了采用同轴电控变焦聚合物分散液晶的多通道频分复用荧光共焦实现方法。该系统的关键器件是同轴液晶透镜，具有集成式设计，易于操作，通过面型和电场调控实现共焦和离焦控制。这样使得频分复用荧光共焦的概念具体的实现成为容易操作，易于实现的系统，同时该系统具有体积小，无运动部件等优点。
技术实现思路
本专利技术是针对现有传统的共焦显微镜和离轴多路频分复用荧光共焦显微系统存在的问题，提出了，系统采用NXN 式透镜阵列来实现斩波，能够实现多点荧光信号的并行实时高速探测，并且具有高的空间分辨率和时间分辨率等特点。本专利技术的技术方案为，骤O搭建NXN通道多频调制激光光路将激光器、扩束镜、同轴H-PDLC透镜阵列、滤波板、透镜同轴依次搭建，并与平台始终保持水平，30mw准直半导体激光器发出的波长为 405nm的光束耦合进扩束镜，扩束镜出射的光束到达NX N式同轴H-PDLC透镜阵列上进行分光和不同频率的斩波调制，使得通过NXN式同轴H-PDLC透镜阵列上的液晶盒阵列的激光的焦点处在滤波板上的小孔位置；2)搭建NXN路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发光路通过焦平面也在同轴 H-PDLC透镜阵列的焦平面F的透镜，将经H-PDLC透镜阵列出射的聚焦的NXN束光调整为平行光束射出，耦合进入二向色镜组中，经二向色镜组激发的405nm的激光将耦合射入到放大倍率为40倍、数值孔径为O. 65的无限远油浸显微物镜，将生物样品摆放于三维调整架之上，调整三维调整架使生物样品恰好处于显微物镜焦平面上，光束将在物镜的作用下在生物样品上聚焦为η2个光点，激发出荧光；3)搭建η2路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像由生物样品表面激发的 520nm-540nm绿色突光在样品与显微物镜相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线，反向通过显微物镜，成为平行光束，入射到二向色镜组上，荧光全部从二向色镜组透射出去，透射出的荧光入射分光棱镜进行第二次分光，分成两部分，其中一部分由消色差透镜会聚聚到CCD摄像机由CCD采集样品的信号最后在计算机中软件中得到样品细胞图像，另一部分荧光经一透镜由光纤耦合器阵列耦合并通过光纤输送到光电倍增管PMT中，该信号属于共焦扫描显微信号；4)信号采集与处理部分的实现光电倍增管PMT将根据生物样品中激发得到的η2个荧光点处的荧光强度的大小，将荧光点处的图像信号，通过光电转换，以电信号的形式输出， 将光电倍增管的输出端接电压放大电路，电压放大电路将PMT采集到的微弱信号进行电压放大，接入数据采集卡，最后由USB接口将信号数据送入计算机，计算机通过Matlab软件， 编写程序，将调制荧光信号通过滤波器滤去高次谐波和部分噪音，并将经过调制的荧光信号相分离，按各自的调制频率进行解调后获取原始荧光信号，得到所需的样品信息。所述同轴H-PDLC透镜阵列由NXN个液晶盒，液晶盒的输入导线，各个液晶盒之间的绝缘带组成。所述液晶盒包括四部分半球型玻璃盖、固定极板、绝缘环、金属导线，首先将绝缘环和半球型玻璃盖组合起来，在他们之间插一根金属导线，确认金属导线和半球型玻璃盖内表面的ITO膜相交，引出的导线通过绝缘带引出来施加电压，再注入H-PDLC材料， 再将固定极板与上述整体装配起来，固定极板上涂有ITO膜，面积和绝缘环内环面积相等， 为了加电压方便，将固定极板上的ITO膜延伸出来，绝缘带上的导线与单个液晶盒的两个电极相连，两个电极为金属导线和固定极板上涂有ITO膜。所述步骤4)中共焦显微镜的横向分辨率Ar和轴向分辨率分别表示为Δγ =，、ΔΖ =，，其中为所激发出的荧光的 a Γa 6NANAΛ波长，J/ Λ表示显微物镜的数值孔径，T为所探测样品的有效折射率，样品中70%是水，可以设定值为1.3。所述步骤4)中解调的具体过程为，先将调制信号与具有相同载波频率的余弦信号相乘，再通过低通滤波器滤去多余的频谱，即可得到原始信号。5本专利技术的有益效果在于本专利技术同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，由于通过驱动电路驱动聚合物分散液晶同轴透镜阵列，来控制焦点的位置，从而实现斩波，通过控制施加在不同液晶盒上的电压，可以达到单点控制的效果，同时还具有横向分辨率、纵向分辨率、时间分辨率高等特点，由于控制的是NXN式透镜阵列，可以实现多点并行实时探测。在荧光共焦探测和生物方面有诸多应用，如可对活体细胞进行实时观测，获取活细胞内的信息，并对所获得的信息进行定量分析，比目前一般的共焦显微探测系统更加便捷、闻效。附图说明图I为本专利技术NXN路频分复用突光共焦显微镜的光路7]^意图2为本专利技术NXN式同轴H-PDLC透镜阵列示意图3为本专利技术单个液晶盒立体示意图4为本专利技术单个半球型玻璃盖剖面图5为本专利技术单个液晶盒对应的绝缘环立体示意图6为本专利技术单个液晶盒对应的固定极板意图7为本专利技术透镜加电及未加电时通过透镜的光线焦点变化示意图8为本专利技术小孔阵列滤波板示意图。具体实施例方式同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法实现步骤如下A:搭建NXN通道多频调制激光光路如图I所示光路示意图，将激光器I、扩束镜2、同轴H-PDLC透镜阵列3、滤波板4、透镜5依次搭建起来。在此过程中需注意光束应尽量从各器件的中心通过并与平台始终保持水平。首先将由30mw准直半导体激光器I发出的波长为405nm的光束稱合进扩束镜2 (用何种波长激光器取决于生物样品中的突光标签,在本实验中生物样本对蓝紫光的敏感度较高，能激发出波长范围本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑继红，张梦华，郭彩虹，桂坤，唐平玉，周增军，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：
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