本发明专利技术涉及一种禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白亚单位疫苗的制备方法。本发明专利技术是通过合成了禽脑脊髓炎VP1基因的引物，构建并获得了一株带有该基因的高效表达载体的重组菌，实现了禽脑脊髓炎VP1蛋白在大肠杆菌中的高效表达，可溶性蛋白表达量约占菌体总蛋白的60％，该表达产物为胞液中可溶性蛋白，具有天然VP1蛋白的抗原活性。利用该重组菌作为生产菌株制备成的禽脑脊髓炎VP1亚单位疫苗能有效地保护禽类免遭禽脑脊髓炎病毒的攻击。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白亚单位疫苗的制备方法，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
禽脑脊髓炎又称流行性震颤，是由禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus, AEV)引起的一种主要侵害雏鸡的传染病，其特征性病理变化为非化脓性脑脊髓炎， 典型症状为运动失调，头颈震颤和渐进性麻痹(赵振华、禹旺盛、郝宪谱等.禽脑脊髓炎的发生与诊断.内蒙古畜牧科学.1994，3 :34-37)。世界几乎所有饲养商品鸡的地区都发生过该病，我国自上世纪80年代以来各地陆续暴发此病，给养禽业带来较大的经济损失。由于本病具有突然出现，难以预测持续期，可通过水平接触和垂直传播等特点，所以对养禽业的危害非常严重，唯一有效办法是通过对产蛋种鸡接种疫苗来预防后代雏鸡的发病。目前国内对禽脑脊髓炎疫苗的研究大多集中在灭活疫苗的研制，国外为弱毒活疫苗的研究报道。AEV是小RNA科肠病毒属成员，基因组为单链正股RNA(Calnek，B. W.，Luginbuhl， R. E. , Helmboldt, C. F. ,1997.Avian encephalomyelitis diseases of Poultry. Iowa State University Press，Ames，IA，pp. 571-581)。AEV 仅有一个翻译起点，编码产生一个多聚蛋白，多聚蛋白在病毒编码的活性蛋白的作用下，级联水解成功能性蛋白，VPl是病毒的四种结构蛋白中的一种，与病毒的侵入及参与构成病毒的抗原成分有关。新加坡的Li Wei (2008)最近报道用细胞表达的VPl亚单位疫苗能有效地保护鸡免受AEV的感染。他们将AEV的主要抗原蛋白VPl、VP0、VP3分别在细胞SF9中进行表达，然后纯化蛋白，制成亚单位疫苗，并对VP1、VP0和VP3生物活性进行了检测，结果发现VP1是主要的抗原蛋白，能有效地保护鸡免受 AEV 的感染(Wei L，Chee LL, Wei T et al. The VPl protein of avian encephalomyelitis virus is a major host-protective immunogen that serves as diagnostic potential. J Virol Methods. 2008Apr ； 149(1) :56-62.)。完整的病原体含有许多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主产生保护性应答。其中某些抗原还能引起过敏，免疫抑制和其他副作用，这是使用完整的病原体做疫苗的缺陷。 并且目前国内应用的灭活苗生产制备抗原过程繁琐，而弱毒疫苗现也有接种疫苗发病情况存在。而用亚单位疫苗则可以解决这个问题，尤其是这种疫苗除了具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，敏感性高，不产生其他不相关抗体，免疫效果检测方法方便准确外，还十分易于生产。不用动物体或是胚体生产，不会带有组织残留物。而且不需灭活，但安全性高。通过对禽脑脊髓炎病毒VPl cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中一段抗原表位较丰富、能够在原核细胞中高效表达的cDNA序列，构建了原核表达载体，进行原核表达， 并成功地表达出可溶性的重组蛋白。利用本专利技术可以生产出禽脑脊髓炎亚单位疫苗，具有商业使用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白的基因合成、表达载体构建及产物的制法，以求在大规模工业化生产中能生产出高效、安全、价廉的禽脑脊髓炎病毒VPl 蛋白亚单位疫苗。实现本专利技术的技术方案为1.构建一种可表达禽脑脊髓炎VPl蛋白的基因工程大肠埃希氏菌将含有所禽脑脊髓炎VPl蛋白基因(序列1)连入克隆载体PM-18T，并转入大肠埃希氏菌DH5CI ；将鉴定正确的阳性质粒PMD18-T-VP1，用ECORI和Mil双酶切后，经1. 2%琼脂糖凝胶电泳，回收到VPl基因；回收的VPl基因连入pET-32a，构建成禽脑脊髓炎VPl蛋白基因的表达载体 pET-3^i-VPl，转化表达型大肠杆菌(Escherichia coli) Rossetta，获得可表达禽脑脊髓炎 VPl蛋白的基因工程大肠埃希氏菌pET-32a-VPl/Rossetta株。2.制备的禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白亚单位疫苗利用构建获得可表达禽脑脊髓炎 VPl蛋白的基因工程大肠埃希氏菌(Escherichia coli)pET_3^i-VPl/Rossetta株作为生产菌株，制备脑脊髓炎VPl蛋白和常规矿物油佐剂而成禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白亚单位疫田ο3.本专利技术涉及的禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白亚单位疫苗是将本专利技术中获得的重组大肠埃希氏菌pET-32a-VPl/ROSSetta接种于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37°C 培养过夜后挑取菌落，在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养液和大肠埃希氏菌培养基(配方为胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%)中培养至菌液OD6c 为0.6 0.8时， 加入终浓度为0. 02M的乳糖，进行诱导培养5 几，离心收集菌体；将收集的菌体用生理盐水进行悬浮，置超声波破碎菌体；经硫酸铵提取、透析后禽脑脊髓炎VPl蛋白；再按常规矿物油佐剂灭活疫苗制备方法制备成疫苗。本专利技术具体实施例方式一、制苗用菌种1.禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白的基因合成、表达载体构建本专利技术设计合成了能生产禽脑脊髓炎VPl蛋白的基因，这种基因含有如下核苷酸序列(序列1)5' -ATGGGGAAAG AGGATGAAGG AGGATTTTCC AGTGTGCCTG AAGTGGAGCA ACATGTTGTT GAGGACAAGG AACCACAGGG ACCTTTGCAC GTGACACCTT TTGGCGCTGT TAAAGCCATG GAGGACCCTC AGTTGGCGAG GAAAACACCT GGTACATTTC CTGAATTAGC TCCTGGTAAA CCTCGACACA CAGTAGACCA TATGGATCTG TATAAGTTTA TGGGGCGTGC CCATTACTTG TGGGGACATA AATTTACCAA AACTGATATG CAGTACACAT TCCAGATACC ATTGAGTCCC ATCAAGGAGG GTTTTGTGAC GGGAACGCTT AGGTGGTTTT TAAGTCTTTT CCAATTGTAT CGTGGTTCTC TCGACATTAC CATGACATTC GCAGGAAAGA CTAATGTAGA CGGCATTGTA TACTTTGTGC CTGAGGGTGT TGCGATAGAG ACTGAGAGGA AGGAACAGAC CCCTCTGCTC ACGTTGAACT ACAAAACATC GGTAGGTGCC ATTAGGTTTA ATACTGGACA AACTACAAAT GTCCAGTTTA GGATCCCTTT CTACACGCCA CTGGAGCACA TCGCAACCCA TTCTAAAAAC GCGATGGACT CAGTCTTGGG GGCAATTACA ACTCAGATCA CCAATTATAG TGCTCAGGAT GAGTACCTGC AGGTC本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭伟伟，王红，徐宝娟，李昌友，宫晓，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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