本发明专利技术公开了一种检测水体沉积物和/或土壤中厌氧氨氧化反应速率的方法。包括如下步骤：(1)将待检测样品在无氧条件下进行培养得到预处理样品；将所述预处理样品分成三部分，分别为预处理样品a、预处理样品b和预处理样品c；(2)向预处理样品a中加入(15NH4)2SO4进行反应，经检测所述反应没有氮气生成；(3)向预处理样品b中加入(15NH4)2SO4和Na14NO3进行反应，经检测所述反应生成29N2；(4)向预处理样品c中加入(14NH4)2SO4和Na15NO3进行反应，检测某时间点下所述反应生成的28N2、29N2和30N2的量，则所述待测样品中厌氧氨氧化反应产生的氮气总量Atotal按照式(a)即得；由得到的氮气总量Atotal即可得到某时间点下待检测样品中厌氧氨氧化反应速率。本发明专利技术提供的方法科学、准确、高效，可广泛地应用于自然界水体沉积物、土壤中厌氧氨氧化活性及脱氮贡献的研究，从而促进厌氧氨氧化研究的发展。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
厌氧氨氧化反应的发现是近十年环境科学领域的重大突破，使人们重新认识氨氧化过程这一氮循环中的限速步骤，也改变了人们对全球氮循环通量的认识。氮迁移转化的传统认识是氨氮由氨氧化细菌(AOB)在氨单加氧酶(amoA)的催化条件下，氧化为亚硝酸盐，由此开始生物氮循环。而最新研究发现，氨的氧化不仅在有氧条件下进行，还可以在厌氧氨氧化菌的作用下，在厌氧/缺氧的条件下被亚硝酸盐氧化而生成氮气，这一过程定义为厌氧氨氧化(anammox)。厌氧氨氧化菌在自然界广泛存在，目前已探明，海洋生态系统中 67%的氮气由厌氧氨氧化反应完成。但是目前关于厌氧氨氧化反应的研究多限于海洋生态系统中， 在大陆表层的研究还很少。厌氧氨氧化反应在自然界中的活性以及对脱氮过程的贡献量是普遍关注的问题，如何准确测定自然界中厌氧氨氧化反应速率并将其与反硝化过程进行区分还是一个难题。目前国内测定自然环境中厌氧氨氧化反应速率的案例较少。国内有研究者向厌氧氨氧化活性污泥中加入NH4+、NO2-和微量元素进行恒温水浴摇床培养，用氮气吹脱污泥 30min后开始实验。取样时，停止摇床摇动使污泥沉降，通入氮气使上清液排出。实验过程中每一小时取样测试，通过测定各个时刻上清液中的基质浓度，绘制基质浓度变化曲线求出最大斜率即为最大厌氧氨氧化速率。由于NH4+和NO2-的浓度变化受其他因素如反硝化等的影响，所以此方法测定的厌氧氨氧化反应速率不准确，且不能反应厌氧氨氧化在脱氮过程中的贡献。同位素示踪技术可以将厌氧氨氧化和反硝化反应区分开来，分别测得两者速率，该思路已在海洋沉积物和水相厌氧氨氧化研究中得到初步应用。该方法主要思路如下反硝化反应是传统硝化-反硝化过程的一部分，在缺/厌氧条件下进行，4个中间过程由硝氮还原酶(NAR)、亚硝氮还原酶(NIR)、一氧化氮还原酶(NO)和氧化亚氮还原酶 (NOS)分别催化完成。反应过程如式(1)所示NO3(1)厌氧氨氧化是以氨氮和亚硝氮分别作为电子供体和受体，由自养的厌氧氨氧化菌在厌氧条件下直接生成氮气的过程，羟胺和联胼是主要中间产物。具体反应过程见式O)NO2NH2OH +nh4+ >N2H4(2) 由反应过程公式可以看出，在缺氧或厌氧的环境下，反硝化反应和厌氧氨氧化反应均产生氮气，但是机理存在差异。反硝化反应由硝氮经一系列中间反应产生氮气，氮气的两个氮原子均来自于NO3—。厌氧氨氧化反应由氨氮和亚硝氮分别作为电子供体和受体产生氮气，氮气分子是由NH4+和NO2-各提供一个氮原子组成的。当进行15N同位素的示踪时，反硝化反应和厌氧氨氧化反应的差异会通过产生氮气中^^、29队和3、2的组成得以体现。通过计算得到反硝化与厌氧氨氧化各自产生的氮气量，反硝化及厌氧氨氧化速率通过各自氮气产生量对时间的回归获得。同位素示踪技术应用于自然生态系统中厌氧氨氧化反应速率的测定准确可靠，并能将厌氧氨氧化反应与反硝化反应区分，从而显现厌氧氨氧化反应在生物脱氮过程中贡献，为厌氧氨氧化反应这个发现的研究提供了简单可行的方法。但由于海洋沉积物与水体沉积物、土壤性质在有机质含量、硝酸盐含量等方面具有较大差异，故该方法不适于直接应用到水体沉积物和土壤厌氧氨氧化反应速率的测定中。对现有测定厌氧氨氧化反应速率的方法作科学的改进，将更适用于水体沉积物、土壤厌氧氨氧化反应速率的测定，同时提高测定效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，为探究厌氧氨氧化反应在自然界生物脱氮过程中的贡献提供准确、可行、高效的方法。本专利技术提供的，包括如下步骤(1)将待检测样品在无氧条件下进行培养后得到预处理样品；将所述预处理样品分成三部分，分别为预处理样品a、预处理样品b和预处理样品c ；(2)向所述预处理样品a中加入(15NH4)2SO4进行反应，经检测所述反应没有氮气生成；(3)向所述预处理样品b中加入(15NH4)2SO4和NaNO3进行反应，经检测所述反应生成；(4)向所述预处理样品c中加入(NH4)2SO4和妝15而3进行反应，检测某时间点下所述反应生成的^^？义和乂的量，则所述待测样品中厌氧氨氧化反应产生的氮气总量&^ 按照式(a)即得；由得到的氮气总量Atotal即可得到某时间点下待检测样品中厌氧氨氧化反应速率；Atotal = F/ X [P29+2 X (l—F/) XP30](a)上式中，Fn表示Na15NO3中15N的丰度，P29表示步骤⑷中所述反应生成的29N2总量，P30表示步骤⑷中所述反应生成的3°n2总量。上述的方法中，步骤(1)中所述无氧条件可为经氮气曝气的加铵水。上述的方法中，步骤(1)中所述培养的时间可为20小时 M小时，具体可为20 小时或M小时，本专利技术采用同位素示踪技术检测水体沉积物和/或土壤中厌氧氨氧化反应速率，所以样品中残存的no3_会对后续同位素示踪处理产生影响，应彻底去除；所述培养步骤中可使N03_经反硝化反应而被去除在厌氧条件下，NO3_与有机质分别作为电子受体和电子供体发生反硝化反应，最终生成氮气。由于海底沉积物中有机质含量明显低于水体沉积物和土壤，而较低的有机质浓度会抑制反硝化反应的顺利进行，故测定海底沉积物中厌氧氨氧化反应速率时，培养预处理时间较长，通常在30小时以上。另外，海底沉积物中硝酸盐含量高于水体沉积物和土壤，故将海底沉积物中硝酸盐消耗完全需要的时间进一步增加了。对于水体沉积物和土壤来说，较少的硝酸盐在较多的有机质存在的条件下反硝化反应能顺利进行，故缩短培养预处理时间既能达到去除残存N03_的目的，又提高了实验效率。上述的方法中，步骤(1)中所述培养的温度可为22 25°C，具体可为22°C或 25 °C。上述的方法中，步骤(2)、步骤(3)和步骤⑷中所述反应的温度可为22 25°C， 具体可为221或251。本专利技术提供的方法中，步骤(2)所述反应用作阴性对照，用以确定该反应体系已去除水体沉积物和/或土壤样品中残存NO3-的干扰；步骤(3)所述反应用作阳性对照，用以确定该反应体系中存在厌氧氨氧化反应且3N2只由反硝化反应产生；步骤中产生厌氧氨氧化反应和反硝化反应，可产生28N2、29NdP3°N2，其中厌氧氨氧化反应产生的氮气是由NH4+ 和N03_各提供一个氮原子组成；该步骤中的厌氧氨氧化反应产生的氮气为aH和fflN2，二者的量由加入NO3-中15NO3-的比例决定，按式(3)计算可得，A28 = Atotal X (I-Fn)，A29 = Atotal XFn (3)其中，A28和A29分别表示厌氧氨氧化反应产生的的aH和29N2的量，Fn为15N03_中 %的丰度。该步骤中的反硝化反应产生氮气的两个氮原子均来自于NO3-;因此，该步骤的反硝化反应产生的氮气应该为％Ν2、2 Η和3°Ν2，它们的量可按式(4)计算可得，D28 = DtotalX (I-Fn)2, D29 = DtotalX2X (I-Fn) XFn, D30 = DtotalXFn2 (4)其中，D28, D29和D3tl分别表示反硝化反应的28Ν2、29Ν2和3°Ν2的量，Dtotal表示反硝化反应产生的氮气总量，将检测步骤(4)中产生的fflN2和3°Ν2的总量标记为P29和P3Q，且D3tl = P3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测水体沉积物和/或土壤中厌氧氨氧化反应速率的方法，包括如下步骤(1)将待检测样品在无氧条件下进行培养得到预处理样品；将所述预处理样品分成三部分，分别为预处理样品a、预处理样品b和预处理样品c ；(2)向所述预处理样品a中加入(15NH4)#04进行反应，经检测所述反应没有氮气生成；(3)向所述预处理样品b中加入(15NH4)2SOjPNaNO3进行反应，经检测所述反应生成29N2;(4)向所述预处理样品c中加入(NH4)2SO4和Na15NO3进行反应，检测某时间点下所述反应生成的1、29N2和miN2的量，则所述待测样品中厌氧氨氧化反应产生的氮气总量Atotal按照式(a)即得；由得到的氮气总量Atotal即可得到某时间...
【专利技术属性】
技术研发人员：祝贵兵，周磊榴，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：
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