分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。以纯化的RRSV重组外壳蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠，获得1株稳定传代并分泌抗RRSV的单克隆抗体的杂交瘤细胞4H5，其保藏号为CGMCCNo.5536。Westernblot检测结果表明细胞株4H5分泌的单抗与RRSV衣壳蛋白有特异性反应。4H5单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链。利用4H5单抗建立的检测褐飞虱和水稻中RRSV的dot-ELISA检测方法，当单头褐飞虱稀释到800?L时，病叶1:320倍稀释(w/v,g/mL)时仍能检测到病毒。建立的dot-ELISA方法能准确、特异、灵敏地检测田间褐飞虱及水稻样品中的RRSV病毒。抗RRSV单抗的制备及其检测方法的建立为该水稻病毒病的诊断、预测预报及科学防控提供技术和物质支撑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
技术介绍
水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus, RRSV)是上个世纪70年代末发现的一种新病毒，在东南亚、东亚和南亚一些国家局部发生，对水稻生产造成一定影响。目前主要发生在我国的广西、福建、湖南、江西、贵州、云南等地。病株表现浓绿矮缩，叶片扭曲呈锯齿状缺刻，在叶背和叶鞘生有细长脉肿。分蘖期前发病不能抽穗，后期发病，抽穗不完全、谷粒不充实等症状。发病田块一般减产10% 20%，严重的减产可达80% 100%，是影响水稻产量比较严重的病毒病害之一。RRSV为呼肠孤病毒科水稻病毒属(Oryzavirus)的典型成员，引起水稻齿叶矮缩病。RRSV基因组包括10条双链RNA片段(Sl-SlO)，其形态结构和基因组双链RNA的电泳图谱与该科另外两个属一植物呼肠孤病毒属(Wiytoreovirus) 和斐济病毒属(Fifivirus)的病毒有较大的区别。RRSV具有双层衣壳，呈二十面体结构，完整病毒粒体的直径约为65nm，核心颗粒约50nm。电镜下可观察到直径50 66nm或是40nm 的病毒粒子分布在感病水稻叶片韧皮细胞的病毒质体(viro-plasm)中；带毒虫体内的器官或组织里也可观察到直径40 45nm或50 75nm两类球形结晶状粒子，聚集或是分散地排列在细胞质的病毒质体中。水稻锯齿叶矮缩病主要是由褐飞虱传播的RRSV病毒引起， 病株液汁、种子和土壤均不传毒。病毒粒子球状，底部有较宽的突起。其自然寄主有水稻、 蟋蟀草、水蜈蚣和稗草，人工侵染的植物有大麦、小麦、燕麦、玉米、甘蔗、稗等10多种。RRSV 的介体昆虫为褐飞虱(Nilaparvatalugens)，是一种迁飞性昆虫，其传播为持久性方式，但不经卵传播。褐飞虱的若虫蜕皮但不失毒，病毒在虫体中的分布以唾液腺中含量最高。介体最小获毒时间是3小时(h)，平均9天(d)。最短的传毒期是lh，接种后10-36d显示症状，传毒率大约为40%。幼虫可能比成虫的传毒效率更高，雌虫和雄虫，长翅型和短翅型传毒效率相同。介体蜕皮时仍传毒，介体传毒通常具有间歇性传毒期，可保持1-4周或终生传毒。褐飞虱的四个型具有相似的传毒特性。为了掌握褐飞虱自然种群带毒及水稻发病状况，强化我国水稻齿叶矮缩病早期监测和预警，科学指导防控，急需建立检测褐飞虱体内及水稻中RRSV的高通量的检测方法，而目前没有这种高通量的检测方法，仅用低效率的电镜观察、RT-PCR方法、核酸电泳等可对小样本进行检测。本专利技术以原核表达的RRSV衣壳蛋白 (CP)为抗原通过杂交瘤技术制备了 1株抗RRSV的特异性单克隆抗体，以制备的单抗为核心建立了检测RRSV的高通量的血清学方法，并成功应用于田间RRSV的检测，从而为我国水稻齿叶矮缩病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No. 5536， 它能分泌抗水稻齿叶矮缩病毒的单克隆抗体。抗水稻齿叶矮缩病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10_7，抗体类型及亚类为IgGl、kappa链，该单克隆抗体能与水稻齿叶矮缩病毒的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法及其免疫学检测试剂盒。本专利技术与现有技术相比具有的有益效果1)提供的杂交瘤细胞株分泌的抗水稻齿叶矮缩病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA 和TAS-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测水稻齿叶矮缩病毒；2)利用本专利技术所制备的单克隆抗体检测水稻齿叶矮缩病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本专利技术所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间水稻作物及褐飞虱中的水稻齿叶矮缩病毒的检测。附图说明图1是dot-ELISA方法检测水稻RRSV的灵敏度分析。感病水稻叶片分别从1 10， 倍比稀释直到1:5120，CK-为健康水稻，1、2为同一样品的重复；图2是dot-ELISA方法检测水稻田间样品中RRSV的结果，CK+为带毒为感染了水稻齿叶矮缩病毒的水稻，CK-为健康水稻；图3是dot-ELISA方法检测褐飞虱体内RRSV的灵敏度分析；图4是dot-ELISA方法检测田间褐飞虱体内RRSV的结果，1、2、3、4、5、6、7、8分别代表 8个田间褐飞虱样品。具体实施例方式分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，于2011年11月观日，保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 5536，它能分泌抗水稻齿叶矮缩病毒的单克隆抗体。抗水稻齿叶矮缩病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10_7，抗体类型及亚类为IgGl、kappa链，该单克隆抗体能与水稻齿叶矮缩病毒的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法及其免疫学检测试剂盒。本专利技术提供的杂交瘤细胞株大量分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单抗，且其特异性强、 效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测RRSV的高通量的免疫学方法及其免疫学检测试剂盒，可成功应用于田间RRSV的检测，从而为我国水稻齿叶矮缩病早期监测和预警， 科学指导防控提供物质和技术支持。下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步说明。一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备 1.免疫原及检测抗原的制备根据GeneBank中报道的水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)的衣壳蛋白基因(CP基因)序列 (登陆号EU523360 )设计特异性引物，RRSV-CP-F =^iTtrCGAATCATCACTGAACAAGTATTTGG 和 RRSV-CP-R :44^7TTCATACACCGGAACCGCTGG,下划线分别为 BamHI 和 HindIII 酶切位点。PCR扩增得到全长约为1500bp的CP基因，目的基因经回收后插入到PMD-18T载体 (RRSV-CP-pMD18T)上并通过PCR和酶切筛选获得pMD_18T_CP重组子，序列测定表明克隆到的CP基因与RRSV CP基因序列完全相同。重组质粒pMD-18T-CP中的CP基因经BamHI 和HindIII双酶切后连接至原核表达载体PMAL-C2X上，获得重组表达载体pMAL_C2X_CP，经 PCR、酶切和测序分析表明CP基因按正确的读码框插入原核表达载体，且碱基未发生突变。 重组质粒PMAL-C2X-CP分别导入大肠杆菌BL21 (DE3)，挑取单菌落于LB培养液中培养，经 0. 5mmol/L IPTG诱导蛋白表达之后发现带有MBP标签的RRSV-CP-pMAL-ch能正确表达大小为SOKDa左右的重组蛋白，并利用MBP柱子纯化，麦芽糖缓冲液洗脱，得到了浓度较高的纯化蛋白。以纯化的重组蛋白为免疫原及检测抗原。2.免疫动本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，周雪平，董静云，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：