黑斑皮蠹与花斑皮蠹的鉴定方法及其专用引物技术

本发明专利技术公开了一种黑斑皮蠹与花斑皮蠹的鉴定方法及其专用引物。本发明专利技术提供的引物对，由引物组1和引物2组成；上述引物对中，所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术根据斑皮蠹属种之间线粒体基因序列差异性，寻找斑皮蠹不同种的物种特异性变异位点，建立对这些斑皮蠹种的分子鉴定体系，最终实现检疫性斑皮蠹及其近缘种的快速、准确、高效鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种黑斑皮蠹与花斑皮蠹的鉴定方法及其专用引物。
技术介绍
斑皮蠹属害虫是重要的仓储害虫。目前对斑皮蠹的鉴定，主要根据形态学特征进行判别。但由于斑皮蠹类成虫个体一般都比较小，且种间的形态差异不明显，经常造成鉴定中的种间混淆。皮蠹个体小，成虫体长2. 0-3. 5mm，且形态酷似不易区分。对成虫的鉴定，主要根据触角棒节数、触角窝深浅、鞘翅颜色及斑纹特点等来鉴别；幼虫体长4. 0-6. Omm, 一般是根据着生的刚毛数量和类型、第8腹节背板前脊沟是否完整和上内唇感觉乳突的个数等来鉴别。皮蠹的形态鉴别需要解剖后在显微镜下观察，例如两者幼虫最重要的鉴别特征为触角和上内唇，只有0. 1-0. 2mm大小，而其上的特征，如刚毛和乳突就更加细小，因此稍有不慎就可能将其破坏或丢失。这就不但需要鉴定工作者有丰富的技术经验并且还得保证皮蠹害虫的完整性，从而使得皮蠹近缘种害虫的形态鉴定成为了日益费时费事的难题。COI基因是动物线粒体DNA中非常保守的编码蛋白基因，它具有相对的保守性同时又有足够的变异，即使是亲缘关系很近的类群也存在几个百分比的差异，所以COI常被用来反映种群遗传变异信息，分析亲缘关系较近的种、种下分类单元等。COI的序列差异性分析在双翅目、直翅目、鞘翅目、膜翅目、缨翅目等昆虫的鉴别中都被用来作为重要的鉴别依据。而且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，使序列比对更容易操作。目前，COI序列差异性分析已经成为物种间分类最普遍的分子标记之一。分子生物学技术手段已被用于昆虫的鉴定分类中，目前对皮蠹属近缘种的鉴定， 主要采用传统的形态分类学，尽管也有采用PCR扩增片段，通过测序来鉴定的方法，但耗时且费用高，还没有相关的快速分子生物学检测方法。因此如何能够快速准确的对斑皮蠹进行鉴定，已成为亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测皮蠹的引物对。本专利技术提供的引物对，由引物1和引物2组成；上述引物对中，所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。上述引物对中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。本专利技术的另一个目的是提供一种检测皮蠹的试剂。本专利技术提供的试剂，由上述引物对和AflII组成。在上述试剂中，所述引物对和所述AflII为独立包装；在上述试剂中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。本专利技术的第三个目的是提供一种检测皮蠹的PCR试剂。本专利技术提供的PCR试剂，由上述的引物对、dNTP、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成；在上述PCR试剂中，所述引物对中的各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. 5μΜ。在上述PCR试剂中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。本专利技术的第四个目的是提供一种检测皮蠹的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括上述的试剂或上述的PCR试剂；在上述试剂盒中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。上述引物对或上述试剂或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测皮蠹中的应用也是本专利技术保护的范围；上述应用中，所述皮蠹具体为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。本专利技术的第五个目的是提供一种检测或辅助检测皮蠹的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤1)用上述引物对或上述试剂或上述PCR试剂或上述试剂盒中的引物对对待测皮蠹进行PCR扩增，得到扩增产物；2)分别用AflII酶切步骤1)得到的扩增产物，得到酶切产物，若所述酶切产物为535bp和347bp大小，则待测皮蠹为或候选为黑斑皮蠹；若所述酶切产物仍为880bp大小，则待测皮蠹为或候选为花斑皮蠹。在上述方法的PCR扩增中，以待测皮蠹的基因组DNA为模板；在上述方法的PCR扩增中，退火温度为50°C-55°C，在本专利技术的实施例中采用的退火温度为55°C。在上述方法中，检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。本专利技术的实验证明，本专利技术根据斑皮蠹属种之间线粒体基因序列差异性，寻找斑皮蠹不同种的物种特异性变异位点，建立对这些斑皮蠹种的分子鉴定体系，最终实现检疫性斑皮蠹及其近缘种的快速、准确、高效鉴定。本专利技术的优点在于1、缩短检测所需时间，从收集样品到检测完毕仅需1天。2、所需样品量大大减少，同时检测精准度大大提高。甚至虫体不完全时也可以进行检测鉴定，且结果可信度高。3、成本大大降低。此外，本方法还弥补了传统分类鉴定中需要提供完整虫体的要求，因为在实际检疫工作中，斑皮蠹属害虫在生活过程中不断在粮粒或其他储藏物内穿行，身上的毛极易脱落，尤其幼虫体表组织柔软，使得有些虫体不能保持完整，而本实验方法即使在虫体不完全时也可以进行检测鉴定。附图说明图1为皮蠹的PCR扩增结果图2为限制酶AflII酶切皮蠹PCR产物的电泳图具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、引物的设计根据已有的谷斑皮蠹的序列(基因序列号FJ58973)，设计引物Tgla-F 5-CAACATTTATTTTGATTT-3 (序列 1)Tgla-R 5-TCCAATGCACTAATCTGCCA-3 (序列 2)实施例2、黑斑皮蠹与花斑皮蠹的鉴定1、皮蠹样品DNA的提取分别取编号为1和2的两头皮蠹分别由黄埔出入境检验检疫局(采集于广州黄埔)和山东农业大学提供(采集于山东泰安)，采用Tiangen组织基因组DNA提取试剂盒 (TIANamp Genomic DNA Kit)，按照说明提取被测样品总DNA。具体为将活虫在200 μ 1 GA缓冲液中研磨碎，混勻后加入20ul蛋白酶K，37°C放置4hr。随后加入200 μ 1 GB缓冲液，混勻后，在70°C放置lOmin。加入200ul无水乙醇，充分混勻15s。将所得溶液转入CB3 吸附柱中，离心，12，OOOrpm，30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CB3中加入 0. 5ml⑶缓冲液，离心，12，OOOrpm，30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CB3 中加入0. 7ml漂洗液PW，离心，12，OOOrpm，30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CB3中加入0. 5ml漂洗液PW，离心，12，OOOrpm，30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。 离心，12，OOOrpm，2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温几分钟，以彻底晾干残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜中央滴加50ul洗脱缓冲液TE，室温放置 5min, 12，OOOrpm离心2min,分别得到1和2的总DNA。2、PCR 扩增分别以上述1得到的1和2的总DNA为模板，以Tgla-F和Tgla-R为正反向引物，加入PCR试剂盒提供试剂(Tiangen)，进行片断扩增，反应体系为20ul，其中2 μ 1 IOXTaqReaction Buffer 缓冲液，1. 25U Taq polymerase, 1 μ 1 dNTP (终浓度 125 μ Μ)， 0. 5μΜ/弓丨物(终浓度0· 5μΜ/引物)，20ng DNA。反应条件为95°C，5min，1个循环；94°C, 30s，55°C，45s，72°C，lmin，35 个循环；最后 72°C延伸 10min，l 个循环。扩增后产物在2%琼脂糖胶中进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：班丽萍，蒋湘，刘聪，樊武疆，王新国，林惠娇，吕英姿，刘二龙，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：