本发明专利技术公开一种番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的测定方法，称取番茄酱样品于离心管中，加入提取液，涡旋，震荡，超声，离心后，取7.0ml上清液于离心管中，同时加入0.8g的硅藻土，涡旋，震荡，离心后，取4.0ml上清液用串联的亲水亲脂平衡固相萃取柱和弱阳离子交换固相萃取柱来同时净化；依次用5.0ml甲醇和5.0ml水分别活化两柱，上样，依次用6.0ml的提取液，6.0ml的水和1.0ml的甲醇淋洗双柱，含3％甲酸的6.0ml的甲醇洗脱，氮气吹干，用0.5ml含0.2％甲酸的乙腈和水溶液溶解残渣，供LC-MS/MS测定。本发明专利技术检测快速、灵敏、准确和经济等特点，具有广泛的实用性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品安全检测领域，具体的，本专利技术涉及一种番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的检测
技术介绍
链霉素(Sti^ptomycin)和双氢链霉素(Dihydrosti^ptomycin)属于氨基糖苷类抗生素中的常用药物，是从放线菌属的灰链丝菌(Sti^ptomyces griseus)的培养液中提取出来，能够有效地抑制肽链的延长和细菌蛋白质的合成，消灭革兰氏阴性好氧菌及部分革兰氏阳性菌。对多种植物细菌和真菌性病害，特别是对细菌性病害均有良好的防治效果，如可以有效的防治西红柿青枯病、西红柿溃疡病、大白菜软腐病和黄瓜细菌性角斑病等。但是，该抗生素对人有一定的毒副作用，如果食品中残留过量的链霉素，则会对人体造成严重危害，如损伤前庭神经和耳蜗神经导致听力减退，链霉素还具有潜在的致畸、致突变和致癌作用。日本肯定列表对于番茄中链霉素和双氢链霉素总量的限量为0. :3mg/kg，美国对于番茄中链霉素的限量是0.25mg/kg。目前，我国是世界第一大番茄制品出口国，番茄制品是我国重要的农产品出口品种之一。经调查，我国多数地区在农业生产中都使用上述抗生素，这就极大的增加了我国番茄制品的出口风险。如实现对番茄制品中链霉素和双氢链霉素残留量检测方法的建立，对提高我国番茄制品检测技术水平，促进我国农产品对外出口，打破国际贸易壁垒等方面具有重要意义。目前，国内外针对链霉素和双氢链霉素残留的检测技术已有大量的研究，常用的检测方法有酶联免疫法、分光光度法、液相色谱法和液相色谱串联质谱法等。酶联免疫法易产生假阳性或假阴性结果，常用于筛查分析；液相色谱法不能有效分离链霉素和双氢链霉素，且灵敏度较低，不能实现链霉素和双氢链霉素的同时测定和确证分析，因而难以解决其混合残留的问题；液相色谱-串联质谱法是目前的主流检测方法，但文献报道的相关方法前处理比较复杂，常需要经过两次固相萃取小柱的净化，试剂消耗量大，并且需要采用离子对试剂，易污染质谱检测器，使质谱的重现性和灵敏度变差。目前，用液相色谱-质谱联用法同时检测番茄酱中链霉素与双氢链霉素残留量的方法还未见报道。番茄酱中番茄红色素的较高，且还含有矿物质、碳水化合物、氨基酸、核黄素和烟酸等物质。上述物质对于链霉素和双氢链霉素的液相色谱质谱法的测定影响很大，净化条件不佳时，待测物的峰型很差和灵敏度很低。净化处理是链霉素和双氢链霉素测定的难点。
技术实现思路
针对现有技术中未见报道专门对番茄酱中链霉素和双亲链霉素测定的技术现状。 本专利技术的目的在于提供了一种番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的快速，经济、灵敏、准确、耐用的确证和定量方法。本专利技术具体提供了一种番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量检测的确证和定量方法。本专利技术的技术方案通过建立了 LC-MS/MS测定番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的方法，通过提取液提取番茄酱样品中的链霉素和双氢链霉素，离心，上清液用分散固相萃取初净化和串联双柱固相萃取净化相结合的方法来净化待测物，氮气吹干后，溶解残渣，供LC-MS/MS测定。本专利技术具体提供了一种番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的测定方法，番茄酱经前处理净化后，用高效液相色谱-串联质谱测定，其前处理步骤如下称取番茄酱样品于离心管中，加入提取液于样品中，涡旋，震荡，超声，离心后，取 7. Oml上述离心后的上清液于15ml的离心管中，同时往离心管中加入0. Sg的硅藻土，充分涡旋，震荡，离心后，取4. Oml上述离心后上清液用串联亲水亲脂平衡固相萃取柱和弱阳离子交换固相萃取柱来同时净化；串联亲水亲脂平衡固相萃取柱为柱1 ；弱阳离子交换固相萃取柱为柱2 ；依次用5. Oml甲醇，5. Oml水分别活化亲水亲脂平衡固相萃取柱和弱阳离子交换固相萃取柱，用6. Oml的磷酸盐缓冲溶液淋洗柱1和柱2，依次加入6. Oml的水和1. Oml 的甲醇淋洗柱2，用含3%甲酸的甲醇溶液6. Oml洗脱柱2中的待测物，氮气吹干，用0. 5ml 含0. 2%甲酸的乙腈和水的溶液溶解残渣，其中，乙腈水=70 30，供LC-MS/MS测定。本领域所熟知，链霉素和双氢链霉素的常用提取试剂有磷酸溶液和磷酸盐的缓冲溶液。本专利技术研究表明，用磷酸溶液提取后，净化后，测定待测物的峰型和灵敏度都不好； 而用磷酸盐的缓冲溶液提取和净化后效果较好。磷酸盐的缓冲溶液对于少量酸碱有一定的缓冲作用，能保持一个相对稳定的PH值，同时保持待测物以一种稳定状态存在。缓冲液中加入少量的乙二胺四乙酸钠能维持溶液的稳定性，同时能与一些阳离子形成稳定的水溶性络合物，这或许能减少对弱阳离子交换柱净化的干扰。因此，本专利技术选择含有少量乙二胺四乙酸钠的磷酸盐缓冲溶液(pH 4)为提取液(称取1. 36g的KH2PO4溶解到950ml水中，用 lmol/L的HCL调节pH为4，然后加入0. 15g的Na2EDTA · 2H20,充分溶解，最后用水定容到 1000ml。)。同时，本专利技术技术方案确定，净化方案中，采用分散固相萃取初净化和串联双柱固相萃取净化相结合的前处理方法，前处理中试剂用量少，无需使用离子对试剂，建立了番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的液相色谱-串联质谱检测技术。众所周知，因番茄酱中成分复杂，单一固相萃取柱已不能满足番茄酱中链霉素和双氢链霉素净化的需要，这就要求使用多重净化的方法来去除番茄酱中影响测定的因素。 本专利技术使用分散固相萃取初步净化和利用串联两个固相萃取柱再净化的方法来去除番茄酱中影响链霉素和双氢链霉素测定的干扰物质。分散固相萃取初净化主要利用一些吸附剂，如采用聚酰胺、氧化铝、佛罗里硅土、 硅藻土和活性炭等去除样品中的极性或非极性的干扰物。本专利技术实验了聚酰胺、氧化铝、佛罗里硅土、硅藻土和活性炭等吸附剂。本专利技术研究结果表明，硅藻土能比较好的吸附番茄酱中一些色素和酸类等物质而又不会吸附待测物。再净化的目的是去除一些极性物质、非极性物质和初净化未除去的色素和酸类物质。本专利技术利用串联的固相萃取柱(SPE)来再净化。通常SPE柱有两种使用方式，一种是利用SPE柱保留住待测物；另一种是利用SPE柱保留住一些干扰物质。现有技术中有利用反相柱和离子交换柱分两次净化，此操作需要离子对试剂，且洗脱试剂的用量大，操作繁琐费时。本专利技术利用亲水亲脂平衡柱(上部柱1)和离子交换柱(下部柱幻串接起来同时净化样品。考虑到待测物极性较强，在柱1中几乎无保留，本专利技术以弱酸性缓冲溶液为提取液，待测物在溶液中以离子化方式存在，提取液通过柱1时，一些非极性杂质主要被保留在柱1中，而待测物无保留的通过柱1进入柱2中。柱2是弱阳离子交换柱，主要保留一些离子化合物，待测物被保留在柱2中，而一些非离子化的物质在柱2中没有保留。为了避免亲水亲脂平衡柱中有残留的待测物，用提取液再淋洗双柱，淋洗不仅洗脱了柱1中残留的待测物于柱2中，同时也洗脱掉了柱2中残留的杂质。用水和甲醇淋洗柱2，除去易溶于水相和有机相的杂质。最后，用酸化的有机相洗脱液洗脱柱2中的待测物供后续处理。双SPE柱串联起来同时净化比用两个SPE柱分别净化节省大量溶剂，且操作简单快速，净化效果好， 回收率高。本专利技术充分考虑到，固相萃取净化时的上样体积和洗脱条件对于链霉素和双氢链霉素残留量的测定有影响。采用上样体积为細1，用6. Oml的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：巩志国，李世雨，员丽娟，季新成，苏敏，尚德军，
申请(专利权)人：新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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