使用随温度而变的杂交对核酸序列进行鉴定与区分制造技术

本发明专利技术提供了一种寡核苷酸探针，其能够以随温度而变的方式与不同的靶核酸序列杂交，允许用相同的探针或具有相同或相似检测特性的报告标记的不同探针对一个以上的靶核酸序列进行检测。本发明专利技术还提供了一种方法，通过使用一种能够以随温度而变的方式与序列进行杂交的寡核苷酸探针，或使用具有相同或相似检测特性的报告标记的不同探针，对靶核酸序列进行检测。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用随温度而变的杂交对核酸序列进行鉴定与区分相关申请的交叉引用本专利技术要求2008年12月10日递交的申请号为61/193，609的美国临时申请的优先权，它的全部内容通过引用并入本文。
技术介绍
核酸扩增技术用于产生单链的核酸产物。对这些扩增产物的典型检测需要一个探针，其用扩增的核酸产物(“靶序列”)来识别特异的核酸序列。这种检测经常通过使用寡核苷酸探针来进行，其在严格的条件下与特异性靶核酸序列杂交，允许检测该特异性靶序列。在现有技术中，通常大约5°C的条件是众所周知的严格的杂交条件，其低于特异性序列在确定的离子强度和PH值下的热熔点(Tm)。所述热熔点是使50%的碱基对分离的温度(在确定的离子强度和PH值下)。尽管条件随序列变化，典型的严格的条件为盐浓度至少约为1. 5至6. OmM，其pH值为7. O至8. 3，温度范围为40°C至72。C。当使用序列特异性探针时，每个靶核酸序列一般需要一个具有用来区别每个靶序列的不同报告标记的不同探针。使用具有不同靶序列和报告标记的多个探针可能增加费用，并导致复杂的探针内相互作用。专利技术概述因此，在本领域中需要一种能够以随温度而变的方式鉴定大多数扩增产物的核酸探针。为了解决这些问题和满足其他需要，本专利技术提供了能够以随温度而变的方式与不同核酸靶序列杂交的寡核苷酸探针，其允许用相同的探针检测一个以上的核酸序列。一个实施例提供了用于检测靶核酸序列的寡核苷酸探针，其中，所述寡核苷酸探针在第一温度下与第一核酸序列杂交，并在第二温度下与第二核酸序列杂交。另一个实施例提供了一种检测两个或多个靶核酸序列的方法。所述方法包括(a) 使寡核苷酸探针在第一温度下与一个或多个靶核酸序列接触(b)改变温度以获得第二温度，然后(c)检测该探针是否在第一温度、第二温度或两种温度下与靶核酸序列杂交，其中，第一温度可能与第一靶核酸序列相关，并且第二温度可能与第二组核酸序列相关。另一个实施例提供了至少两个用来检测两个靶核酸序列的寡核苷酸探针。其中， 每个寡核苷酸探针具有一个具有相同或相似检测特征的报告分子，比如，例如相同的报告分子，但是所述探针被设计在不同温度下杂交。一个寡核苷酸探针可在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，第二探针可在第二温度下与第二靶核酸序列杂交。可在每个探针分别对应的温度下，通过增加报告分子信号来测定两种杂交情况的分化。另一个实施例提供了一种使用两个或多个寡核苷酸探针来检测两个或多个靶核酸序列的方法。所述寡核苷酸探针标有相似或相同检测特征的报告分子，比如，例如相同的报告分子，但是所述探针被设计成在不同温度下与它们各自的靶核酸序列杂交。所述方法包括(a)在第一温度下使具有报告标记的寡核苷酸探针与一个或多个靶核酸序列接触； (b)改变温度以获得第二温度；然后(C)在第二温度下测定具有相同的报告标记的第二探针是否与其靶核酸序列杂交，其中，在第一温度下的信号可能与第一靶核酸序列相关，而且第二温度下的信号可能与第二核酸序列相关。在一个实施例中，可以使用额外的具有报告标记的探针，并且每个探针能够在确定的温度下与一个靶核酸序列杂交。一个实施例提供了一种试剂盒，其包括扩增试剂混合物和至少一个寡核苷酸探针，所述扩增试剂混合物包含至少一对用于扩增一个或多个靶核酸序列的引物，其中，寡核苷酸探针在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，在第二温度下与第二核酸序列杂交。另一个实施例提供了一种试剂盒，其包括扩增试剂混合物和至少两个寡核苷酸探针，所述扩增试剂混合物包含至少一对用于扩增一个或多个靶核酸序列的引物。所述探针每个都具有一个具有相似或相同检测特征的报告标记，包括，例如，相同的报告标记，其中，第一寡核苷酸探针在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，第二探针在第二温度下与第二核酸序列杂交。所述至少两个寡核苷酸探针可增加到两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、十个、或十一个以上、十二个、十五个或二十个探针。在另一个实施例中，示出了一种探针，其包括用于检测靶核酸序列的寡核苷酸探针，其中，寡核苷酸探针在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，在第二温度下与第二核酸序列杂交。在另一个实施例中，示出了一种检测两个或多个靶核酸序列的方法。所述方法包括a.在第一温度下使一个寡核苷酸探针与一个或多个靶核酸序列接触；b.改变温度以获得第二温度；以及c.在第一温度、第二温度或两种温度条件下确定该探针是否与靶核酸序列杂交。在另一个实施例中，示出了一种如上和/或如下所述的方法。其中，第一温度与第一靶核酸序列相关，而且第二温度与第二靶核酸序列相关。在另一个实施例中，示出了一种如上和/或如下所述的方法。其中，第一温度与第一靶核酸序列是可相关的，第二温度与第二靶核酸序列是可相关的。在另一个实施例中，示出了一种试剂盒，其包括一种扩增试剂混合物和至少一个寡核苷酸探针，所述扩增试剂混合物含有一对或多对用于扩增一个或多个靶核酸序列的引物，其中，所述寡核苷酸探针在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，在第二温度下与第二核酸序列杂交。 在另一个实施例中，示出了一种包括至少两个寡核苷酸探针的组合物。其中，所述寡核苷酸探针具有相同和/或相似检测特征的报告标记，其中，第一寡核苷酸探针在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，第二探针在第二温度下与第二靶核酸序列杂交。其中，在第一温度下检测第一靶核酸序列，在第二温度下检测第二靶核酸序列，其中，在第一温度下对报告标记的检测表明了存在第一靶核酸序列，在第二温度下对报告标记的检测表明了存在第二靶核酸序列。在另一个实施例中，示出了一种使用两个或多个寡核苷酸探针来检测两个或多个靶核酸序列的方法。所述寡核苷酸探针用一个报告分子标记，其具有至少一项下列相同和相似的检测特征(i)在第一温度下使一个具有报告标记的寡核苷酸探针与一个或多个靶核酸序列接触；(ii)改变温度以获得第二温度；(iii)在第二温度下，确定具有报告标记的第二探针是否与靶核酸序列杂交。在如上和/或如下公开的另一个实施例中，示出了一种方法。其中，在第一温度下的信号与第一靶核酸序列是可相关的，在第二温度下的信号与第二组靶核酸序列是可相关的。在如上和/或如下公开的另一个实施例中，示出了一种方法，其中，在第一温度下的信号与第一靶核酸序列相关，在第二温度下的信号与第二靶核酸序列相关。在另一个实施例中，示出了一种试剂盒，其包括一种扩增试剂混合物和至少两个都具有相同或相似检测特征的报告标记的寡核苷酸探针，所述扩增试剂混合物含有至少一对用于扩增一个或多个靶核酸序列的引物。其中，第一寡核苷酸探针在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，第二探针在第二温度下与第二核酸序列杂交。通过下文的详细描述对如上所述和其他特征进行说明。专利技术详述一种能够以随温度而变的方式与不同的扩增产物杂交的寡核苷酸探针(“耐错配探针”或“随温度而变的探针”)是十分有用的。通过在不同温度下使用耐错配探针并测定探针的杂交来确定由靶扩增序列的先验认识得知的特异性靶序列的存在。随温度而变的探针可具有对靶核酸序列的多重检测、鉴定及识别等优点。然而，除非另有说明，所有使用的技术和科学术语都遵循常规技术使用方法。一般的，这种描述的术语和所述的实验程序，分别在细胞培养、分子遗传学、核酸化学及杂交领域众所周知，并且在本领域普遍应用。将标准技术应用于重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种探针，其包括用于检测靶核酸序列的寡核苷酸探针，其中，所述寡核苷酸探针在第一温度下与第一核酸序列杂交，并且在第二温度下与第二核酸序列杂交。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·W·查卡，
申请(专利权)人：史密斯探测公司，
类型：发明
国别省市：US