细胞保存方法和细胞运输方法技术

本发明专利技术提供以维持活细胞的功能的状态保存活细胞的细胞保存方法。细胞保存方法的一个方式是使用具有多个微容器（１１）的细胞培养容器（２０）来保存活细胞（４０）的方法，其中，使活细胞粘附于多个微空间的表面来进行培养，在培养后，将培养基（５０）向细胞培养容器（２０）注入，以覆盖多个微容器（１１）。在适当大小的细胞培养容器中粘附活细胞，进行培养，形成三维结构体，由此可以以维持活细胞的三维结构体、且维持功能的状态保存活细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞保存方法和细胞运输方法
本专利技术涉及保存活细胞的细胞保存方法和细胞运输方法。
技术介绍
将从组织分离出的细胞用于试验、检验的方法，是生物技术相关领域中不可欠缺的方法。其广泛用于疾病、病情的诊断、新药的探索和药效的判定、或者动物检验、植物检验、环境污染物质的试验等。因此，在生物
中使用的细胞类别极其多样化。分离得到的细胞也有直接用于试验的情况，但多数情况下是在培养皿或试管中进行细胞培养。使用该培养细胞，进行各种检验。对于用于细胞培养试验的细胞培养株，要求其表现与在生物体内的试验、即所谓体内（invivo）试验同样的药物感受性、毒性反应。即，需要在细胞培养容器的表面能够构筑有规则性地排列的细胞间的网络。另外，由于在细胞培养试验中使用的细胞培养株极为昂贵，因此期望提高细胞的生存率和增殖速度。上述细胞培养试验是在同一条件下，以将评价的药物等的量、浓度等为变量，测定其效果。因此，细胞培养容器的材质、形状等也需要相同。作为该细胞培养容器，一般使用塑料制平皿、玻璃制平皿、固定在容器内的玻璃板、孔板等。孔板有6孔、12孔、48孔、96孔的各板或平皿。它们一般与整个板的大小几乎相同，孔数越大，1个孔的尺寸越小。该1个孔相当于1个培养皿。另外，由于最近的微量化的趋势，因此也开始使用包含更小口径且多量的培养皿的384孔板。这些培养皿的底部是平坦的平板状，使用该底面作为培养面。但是，在组织细胞的培养中，如果使用现有的细胞培养容器，则细胞薄薄地铺展，形成没有方向性的形态。另外，由于在细胞培养容器的表面无规则地配置，因此细胞间的网络复杂地交织而形成。因此，存在不能重现在生物体内的细胞功能的问题。例如，不能形成在肝细胞中维持肝功能的已知的球体状的肝细胞团。为了解决上述问题，公开了在平板状的培养面将特殊的高分子固定化的方法(参考专利文献1)、使用特殊的装置的方法(参考专利文献2)、在高分子凝胶中进行培养的方法(参考专利文献3)等。但是，在专利文献1记载的方法中，存在固定化方法繁杂、不能稳定地制造、且成本高的问题。另外，在专利文献2记载的方法中，无论培养方法的复杂，仍存在细胞团的形成效率差，成本高等的问题。在专利文献3的方法中，有不能控制细胞团的大小、另外基板的操作性繁杂等的问题。这样，这些方法都繁杂，不能稳定地制造，且成本高。专利文献1:日本专利第3177610号公报专利文献2:日本特开平7-79772号公报专利文献3:日本特开平8-308562号公报。
技术实现思路
从生物体分离的活细胞期望在与生物体同样的环境下保存。例如，当保存非冷冻的肝细胞时，在平面状的培养板粘附肝细胞，装满培养基，置于保温(例如25~37℃)状态下进行保存。但是，当在平面上培养细胞时，与生物体内的环境大为不同，因此存在使细胞具有的原本的功能丧失的问题。另外，由于培养中或保存中的环境要素、例如振动、温度、CO2浓度(培养基的pH的变化)等，有细胞的功能进一步降低这样的问题。另外，如果用专利文献1或专利文献2公开的方法保存培养的细胞，则在发生振动等时，有由细胞的剥离或凝胶的损坏导致细胞凋亡等的担心。因此，难以在维持活细胞的三维结构体的状态下直接保存而运输，难以在离开分离位置的位置利用。另一方面，从组织分离细胞的机制与进行试验、检验的机制有许多不同，因而期望在不降低分离的细胞的功能的情况下进行保存、运输。本专利技术是为了解决这种问题而作出的专利技术，其目的在于提供在维持细胞功能的状态下保存活细胞的细胞保存方法和细胞运输方法。本专利技术的细胞保存方法的一种方式是使用具有多个微空间的细胞培养容器来保存活细胞的细胞保存方法，使活细胞粘附在上述多个微空间的表面来进行培养，在上述培养后，将培养基向上述细胞培养容器注入，以覆盖上述多个微空间，将上述细胞培养容器密封，以使培养基不漏出，进行保存。在微空间的表面粘附活细胞，使用适于培养的微空间进行培养，在各微容器内形成三维结构体，利用微容器隔离三维结构体后，进行密封并保存，由此能够以维持功能的状态保存活细胞。另外，上述细胞培养容器优选保持在4℃以上且小于37℃的温度、来保存上述活细胞。进一步地，优选进行培养，以使粘附于上述表面、且在各微空间的空间内形成的三维结构体的细胞群体形成被隔离的细胞数。通过使用微空间，可以防止在各微空间培养的活细胞与其他微空间的活细胞接触。上述多个微空间优选底部面积为0.01~0.1mm2、深度为25~150μm，另外，上述活细胞是肝细胞、胰β细胞、心肌细胞、神经细胞、皮肤上皮细胞、软骨细胞、骨细胞、组织干细胞、ES细胞和iPS细胞中的任一者，或者更优选由组织干细胞、ES细胞和iPS细胞中的任一者分化的、肝细胞、胰β细胞、心肌细胞、神经细胞、皮肤上皮细胞、软骨细胞、和骨细胞中的任一者。更优选在上述培养后，除去非粘附细胞后将上述培养基向上述细胞培养容器注入，上述活细胞的培养优选在使活细胞粘附并培养后，可以进一步进行培养，使其增殖、铺展或者聚集。更优选以1×102~1×106细胞/cm2的细胞接种密度将活细胞接种到上述多个微空间中，更优选细胞接种密度为1×104~1×106细胞/cm2。在上述多个微空间中，优选形成活细胞集聚的细胞团，更优选上述细胞团的直径为30~200μm。上述培养基更优选下述情况中的至少一种，即，含有血清、增殖因子和血中成分中的至少一种，和使用可透过氧或二氧化碳的膜来密封上述细胞培养容器。另外，本专利技术的细胞运输方法的一种方式是将活细胞保存在具有多个微空间的细胞培养容器中并运输的细胞运输方法。该运输方法首先使活细胞粘附在上述多个微空间的表面来培养。上述培养后，将培养基向上述细胞培养容器注入，以覆盖上述多个微空间。然后，将上述细胞培养容器密封，以使培养基不漏出。并且，使用车辆、船舶或者航空器中的任一种运输装置将密封的上述细胞培养容器进行运输。利用该细胞运输方法，能够以维持活细胞的功能的状态进行运输。另外，上述细胞培养容器优选保持在4℃以上且小于37℃的温度。根据本专利技术，可以提供以维持细胞功能的状态保存活细胞的细胞保存方法和细胞运输方法。附图说明图1是表示实施方式的细胞培养容器的构成的平面图。图2是表示实施方式的细胞培养容器的构成的II-II截面图。图3是表示实施方式的细胞培养容器的其他的构成的平面图。图4是表示实施方式的细胞培养容器的其他的构成的IV-IV截面图。图5是表示实施方式的细胞培养容器的进而其他的构成的平面图。图6是表示实施方式的细胞培养容器的进而其他的构成的VI-VI截面图。图7是表示使用图5和图6所示的细胞培养容器培养细胞并进行密封的状态例的图。图8A是表示实施例06的结果的照片。图8B是表示实施例07的结果的照片。符号说明10、20细胞培养容器11微容器12侧壁13开口部23处所（スポット）24处所的侧壁30密封装置40活细胞50培养基。具体实施方式本专利技术的细胞保存方法的一种方式是，使用适于活细胞培养的细胞培养容器，使活细胞粘附于微容器进行培养，在微容器内形成三维结构体，培养后在细胞培养容器中装满培养基进行保存。微容器使活细胞的三维结构体形成、另外维持其结构。另外，微容器将在内部形成的活细胞的三维结构体与其他的活细胞的三维结构体隔离。因此，培养活细胞的微容器需要使用合适的微本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．细胞保存方法，其是使用具有多个微空间的细胞培养容器来保存活细胞的细胞保存方法，其中，使活细胞粘附于上述多个微空间的表面进行培养，在上述培养后，将培养基向上述细胞培养容器注入，以覆盖上述多个微空间，将上述细胞培养容器密封，以使培养基不漏出，保存上述活细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP2008-2738462008年10月24日1.细胞保存方法，其是使用具有多个微空间的细胞培养容器来保存肝细胞的细胞保存方法，其中包括，上述微空间通过微容器形成，上述微容器的四边被侧壁完全地围住，培养工序：使肝细胞粘附于上述多个微容器的表面进行培养，在各上述微容器内形成三维结构体，保存准备工序：在上述培养后，除去非粘附细胞后将培养基向上述细胞培养容器注入并进行保存的准备，以覆盖上述多个微容器，保存工序：将上述细胞培养容器密封，在维持上述三维结构体的状态下，以使培养基不漏出，保存上述肝细胞，上述细胞培养容器保持在10℃以上且小于20℃的温度来保存上述肝细胞，在上述培养工序中，各上述微容器内的上述三维结构体用上述侧壁与其他的上述三维结构体隔离，以使上述三维结构体与相邻的上述三维结构体不相接，上述三维结构体是上述肝细胞集聚的球状细胞团。2.根据权利要求1所述的细胞保存方法，其特征在于，进行上述培养，以使粘附于上述表面、且在各微空间的空间内形成的三维结构体的细胞群体形成被隔离的细胞数。3.根据权利要求1所述的细胞保存方法，其特征在于，上述多个微空间的底部面积为0.01~0.1mm2，深度为25~150μm。4.根据权利要求1所述的细胞保存方法，其特征在于，上述肝细胞的培养为，在使肝细胞粘附并进行培养后，进一步进行培养，使其增殖、铺展或者聚集。5.根据权利要求1所述的细胞保存方法，其中，以1×10...

【专利技术属性】
技术研发人员：一丁田洋子，
申请(专利权)人：可乐丽股份有限公司，
类型：发明
国别省市：JP