宫颈细胞的细胞学分析方法技术

本发明专利技术提供用于监测癌症特异性遗传变异的诊断检查，用于诊断宫颈细胞病变和预测可能发展成癌症的患者。本发明专利技术采用ＦＩＳＨ分析法检测靶向３ｑ和／或５ｐ的探针来测定染色体３和染色体５的拷贝数，由此检定遗传变异。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于分析宫颈细胞染色体异常的方法和试剂盒。
技术介绍
宫颈癌是世界范围内最常见的女性高死亡率癌症之一。如果能够早期诊断，宫颈癌及其预兆性病变(precursor lesions)是能够得到有效治疗的。主要的宫颈癌筛查方法是Pap检查，该方法采用形态分析法来确定可疑细胞。然而，单纯细胞检测的灵敏度、再现性和可靠性相对较低。宫颈刮片(Pap)检查中约6%诊断为显著性未明的非典型性鳞状细胞(AS⑶S)，需要随访检查，5-10%的AS⑶S患者没有测出癌症。目前建议患者随访Pap检查、人乳头瘤病毒(HPV)检查和/或阴道镜检。HPV感染与宫颈癌相关，许多患者在获得AS⑶S Pap检查结果后进行HPV检查。高灵敏HPV检查的优点在于其极高的阴性预测值，该项检查为阴性的女性很少患上宫颈癌。 然而，HPV检查的阳性预测值不高，只有少数HPV阳性的早期病损发展为高度异常增生和癌症。因此，即使与细胞形态学检查联用，HPV检查的特异性仍然较低。此外，约3%的Pap检查诊断为低度鳞状上皮内病变(LSIL)。目前建议患者进一步监测和/或阴道镜检。临床研究显示，这些患者大多为HPV+。AS⑶S/HPV+或LSIL患者有发展为更严重宫颈疾病的显著风险，在首次检查后两年内需要手术治疗。形态和HPV感染无法确定这些高危患者。已发现的宫颈癌早期的遗传变异能够预测病变的风险。这些变异包括DNA含量(例如染色体倍性)的总体改变以及3 号染色体上基因座3明6部分和5号染色体上基因座5pl5部分的扩增，基因座3明6包含一 TERC基因，该基因编码端粒酶蛋白的一亚基，基因座5pl5包含一 TERT基因，该基因编码端粒酶蛋白的另一亚基，两者都与细胞的无限增殖相关。研究表明，多色荧光DNA探针可通过荧光原位杂交(FISH)检测倍性异常以及检测3q和5p拷贝数异常，其灵敏度和特异性均高于其他方法。发达国家中宫颈癌筛查计划的推进极大降低了发病率和死亡率。然而，由于单纯细胞学检查的灵敏度欠高，所以需要经常性的随访检查。这可能是因为取样和解读误差，也可能是因为某些早期病变尚未具有可识别的表型改变。浸润性宫颈癌通过渐进诸阶段的宫颈非典型增生(cervical dysplasia)发展成宫颈上皮内瘤(CIN) 1、CIN2、CIN3，和原位癌， 这被认为是真性(bona fide)癌前病变，需要手术干预。然而，所有低度异常增生中只有约 15%遵循这样路径发展。Pap和HPV检查时检测宫颈非典型增生或宫颈癌的间接方法。所以，仍然需要用分子标记来直接确定异常增生或宫颈癌并监测疾病进展的方法。专利技术概述本专利技术提供监测宫颈细胞遗传变异从而在普遍症状出现前数年或数月预测发病可能性的方法，该方法采用FISH、CISH、流式细胞术等各种细胞学方法或其它业内已知方法来检测杂交和遗传变异。显示染色体非整倍性和特定癌症-相关基因拷贝数改变已经成为细胞学样品的5常规形态学分析的重要补充。该方法在生物学上是可靠且成功的，因为染色体非整倍性及其所致的基因组失衡是癌细胞特异性的，随癌症不同而不同，并且出现于病程的早期。像许多人类癌症一样，宫颈癌是由基因组失衡引起的。在人乳头瘤病毒高危亚型感染之外，宫颈鳞状上皮细胞循序转化需要获得超拷贝的染色体臂3q和5p，以及其他细胞遗传变异。本
技术实现思路
之一，鉴定低度宫颈异常增生中的5pl5扩增和3q26扩增能够提供关于各病变发展为高度宫颈非典型增生和癌症可能性的信息。内容之一，本专利技术提供一种评定患者宫颈细胞异常状况的方法，所述异常包括宫颈非典型增生或宫颈癌，所述方法包括在患者的样品中检测染色体3q的基因组扩增；染色体5p的基因组扩增；和作为对照的染色体7着丝粒(CEN7)的存在和/或扩增。检测到染色体3q和染色体5p的基因组扩增显示患者病情向高度宫颈非典型增生转化。检测到染色体7基因组扩增可度量宫颈细胞的整体染色体倍性。通常，宫颈癌变早期不发生染色体7 拷贝数变化。如果出现染色体7基因组扩增则表示出现了非整倍性，这是一种与晚期癌前和癌症相关的状态。该方法能够评估低度宫颈非典型增生向高度宫颈非典型增生或宫颈癌的转变。本专利技术还提供一种监测由低度向高度宫颈非典型增生转变的方法。本专利技术所揭示的方法包括评估低度宫颈非典型增生向高度宫颈非典型增生的转变；确定患者产生浸润性宫颈癌的风险；和评估维持低度宫颈非典型增生或消退到低度宫颈非典型增生或正常的情况。具体实施方式之一中，本专利技术所述方法还包括在检测染色体3q和5p上的扩增之外检测以下染色体上的扩增lq、20q、12q、19q、llq、6q、17p、7、8q(见于细胞病变晚期)、 9q、16q、2q、9p、10q、18p，以及它们的各种组合。更具体的实施方式中，所述方法检测3q26 基因座和5pl5基因座的扩增。除了检测基因座3q26和5pl5扩增之外，还可以检测以下染色体基因座的扩增lq21-31、20ql2、12ql3-24、19ql3、llq21、7qll-22、8q24(在晚期异常增生中检测)、9q33、_34、16q23 ；2q32、9p22、10q21_24、18pll，以及它们的各种组合。本专利技术的方法还可以包括在样品中检测染色体3q和/或染色体5p有无遗传扩+飽+曰ο本专利技术还提供指向所述染色体区域的探针，以及用于实施本专利技术方法的试剂盒。以下表述和附图将有助于更好地理解本专利技术的以上及其它内容。然而，以下表述展示本专利技术优选实施方式及其诸多细节仅是为了说明本专利技术而非限定其范围。根据本专利技术的要旨，其范围内还包括诸多改变和调整。附图说明图1A、B和C显示宫颈癌各阶段3q26染色体拷贝数的扩增。图2显示显示宫颈癌各阶段3q26和5pl5染色体拷贝数的扩增。图3展示以宫颈癌检测为目的的Pap检查后病员管理流程。图4是一例3q异常单项液基细胞检查阴性报告。图5是一例3q异常单项液基细胞检查阳性报告。图6是一例3q和5p异常液基细胞检查阳性报告。图7是一例3q和5p异常液基细胞检查阴性报告。图8A和B是一例3q异常单项组织活检阴性报告。图8A为Cim组织活检结果， 图8B为CIN2组织活检结果。图9A、B和C 一例3q异常单项组织活检阳性报告。图9A为Cim组织活检结果， 图9B为CIN2组织活检结果，图9C为CIN3组织活检结果。图10显示一例3q和5p异常组织活检结果。图11显示一例四倍体细胞3q异常单项液基细胞检查结果。图12显示一例四倍体细胞3q和5p异常液基细胞检查结果。图13显示染色体基因座3明6的基因组组成，包括TERC以及其他众多基因的位置，以及适合用来制备标记DNA探针的BAC克隆。图14显示染色体基因座5pl5的基因组组成，包括TERT和TRIP13以及其他众多基因的位置，以及适合用来制备标记DNA探针的BAC克隆。图15显示用来在5pl5. 33带内鉴定探针的克隆排列以及适合制备TRIP 13特异性标记DNA探针的特异性BAC克隆。图16A、B、C和D列明了本专利技术用于检测宫颈细胞内染色体异常的特异性探针所靶向的基因。详细说明本专利技术的基础是宫颈癌相关染色体区域拷贝数增益的测定。癌症是一种遗传疾病，在病变细胞内可发现遗传变异。这些变异可用细胞学方法来观测，例如根据某些基因区域本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种在样品中检测染色体异常，从而确定是否存在宫颈细胞病变的方法，所述方法包括：将患者的样品与核酸探针杂交，所述探针结合染色体５ｐ上的靶核酸序列；将患者的样品与核酸对照探针杂交，所述对照探针结合染色体７的着丝粒（ＣＥＮ７）；和检测染色体５ｐ和ＣＥＮ７上形成的杂交复合物，其中检测到所述杂交复合物表明染色体拷贝数与正常细胞相比升高，并与宫颈细胞病变的存在相关。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·A·恩德斯，
申请(专利权)人：新诊断学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US