本发明专利技术为一株多菌灵降解木霉菌株及其制备方法。本发明专利技术所提供的生防菌株为木霉（Trichoderma?sp.）Tr1，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC?No.5210；该菌株是利用含有多菌灵的无机盐培养基，从受多菌灵污染的土壤中分离、筛选、培养获得的；应用该菌株的发酵菌液制得的微生物制剂，可用于防治植物真菌病害，同时对受到多菌灵污染的土壤进行生物修复。
【技术实现步骤摘要】
本发 明属于生物高
，涉及一种多菌灵农药残留降解木霉，是利用微生物的方法降解化学农药残留，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。
技术介绍
多菌灵(Carbendazim，MBC)是一种广谱高效低毒的内吸性杀菌剂，化学名称为 N-(2-苯并咪唑基)氨基甲酸甲酯，对各种农作物、瓜果蔬菜病害具有较好的防治效果，也是其他杀菌剂，例如苯菌灵、甲基硫菌灵等咪唑类杀菌剂的代谢中间产物。据统计，我国2006 年农药需求总量(有效含量)为29. 96万吨，其中多菌灵的需求量在0. 8 1. 0万吨。多菌灵在土壤和水中性质非常稳定，降解半衰期较长，在蔬菜、果品和土壤中残留与累积可通过食物链影响人体健康，例如导致染色体畸变，引起肝病等。2002年被我国列为环境激素类化学农药。因此，多菌灵在环境中的降解研究愈来愈受到人们的关注。生物降解是去除环境中多菌灵残留的主要途径，目前已报道的多菌灵降解菌均为细菌类。现有的木霉菌类对多菌灵几乎没有降解功能，甚至在多菌灵污染严重的土壤中无法生存和繁殖。
技术实现思路
本专利技术目的是针对现有技术的不足，提供一株具有多菌灵降解作用的生防木霉菌株及其制备和应用。本专利技术提供的一株可降解多菌灵的生防菌株为木霉577. )Trl，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；保藏号为CGMCC No. 5210，保藏时间为2011年9月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术所述的可降解多菌灵的木霉菌株(TricAoiferffl3 sp. ) Trl是利用含有多菌灵的无机盐培养基，从受多菌灵污染的土壤中分离、筛选、培养获得的。该菌株不仅对多菌灵具有良好的降解效果，对各种病原菌也具有一定的抑菌效果。该专利技术为获得降解多菌灵的木霉菌制品奠定了基础。本专利技术所述的可降解多菌灵的生防菌株木霉sp. ) Trl的分离培养条件，包括下列步骤采集日照东港区三庄镇吉洼村某长期施用多菌灵的葡萄园耕作土层(10-30cm),称取土样10g，加到IOOml多菌灵浓度为ΙΟΟΟμ g/ml的无机盐培养基中，28°C 150r/min摇床培养7d，吸取IOml培养液转接到相同培养基中，培养7d，共连续转接5次。取Iml培养液，稀释10_5，取200μ 1培养液均勻涂布于固体无机盐培养基(其中添加100μ g/ml链霉素用于抑制细菌)中，28°C培养至平板上出现单菌落，将菌株转接到PDA平板(其中添加100 μ g/ml 链霉素用于抑制细菌)上，28°C恒温培养，反复纯化至纯培养后，转接到无机盐培养基中继续摇床培养，利用HPLC检测 菌株对多菌灵的降解能力，筛选对多菌灵降解能力最强的菌株进行保藏，即为保藏号为CGMCC No. 5210饱木霉(Jrichoderma sp. ) Trl菌株。将上述培养筛选获得的菌株转接到PDA平板上，发现该菌株在PDA平板上菌落初期气生菌丝呈白色致密丛束状，边缘松散，呈发散状生长，背面初期无色，后期出现菌丝产孢区，颜色从浅绿渐至深绿色。分生孢子梗从菌丝侧枝生出，呈十字轮生排列，顶生分生孢子，分生孢子光滑，亚球形至卵形(图1 )。通过一系列培养形状及光学显微镜观察，经鉴定为M (Trichoderma sp.\上述培养、筛选木霉sp. ) Trl的培养基配方如下无机盐培养基(g/L) =NaCl 1. 0g, K2HPO4 1. 5g，KH2PO4 0. 5g，MgSO4·7Η20 0. 2g，NH4NO3 1. Og,蒸馏水 lOOOmL，多菌灵(100mg/mL) 10ml。固体无机盐培养基(g/L)上述无机盐培养基中添加琼脂10g。PDA培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml。本专利技术所述木霉(Trichoderma sp. ) Trl的发酵生产方法如下采用固体PDA培养基，将该木霉Trl接种在试管培养基上，27-30°C下培养48h后，将培养好的木霉菌种转接到液体PDA培养基中，28°C摇床培养72h。将液体培养好的木霉菌株按照1% (v/V)的接种量转接到小麦培养基中，27-30°C扩大培养3d。清洗已培养好的木霉菌株，制成7 X IO9个/ml的木霉孢子悬浮菌液。上述所得到的木霉孢子悬浮菌液可经常规工艺流程制成商品微生物制剂。上述小麦培养基为将小麦用清水浸泡、煮沸所制得的液体小麦培养基。具体配方实例如下称取IOOOg麦粒，清洗干净后，加10L清水浸泡过夜，第二天煮沸至不发硬为止，同时用手感觉麦粒不发粘，分装广口玻璃瓶40瓶，121°C，20min高压灭菌，两次。应用本专利技术所述木霉577. )Trl发酵菌液制得的微生物制剂，可用于防治植物真菌病害，同时对受到多菌灵污染的土壤进行生物修复。附图说明图1是木霉Trl分生孢子梗及分生孢子图2是多菌灵降解菌Trl对各种病原菌的抑菌效果。1 -.Rhizoctonia solani ；2 Phytophthora capsici ；3 Verticillium dakIiae Kleb ；4 -.Phoma uvicola Berk ；5 Bipolaris sorokiniana (Sacc. ) hoemaker ；6 -.Fusarium moniliforme Sheld 图3是木霉Trl对含多菌灵土壤的生物修复。具体实施例方式实施例1.ifMCTrichodenm sp. ) Trl的培养及多菌灵降解能力检测将木霉Trl转接到PDA (添加链霉素，100 μ g/ml)平板上，培养5D后，用无菌水冲洗孢子，制成IO9个/ml孢子悬浮液，按照1%的接种量转接到无机盐培养基中，28°C摇床培养 14D，以不接菌的多菌灵降解培养基为对照。培养完毕，按照体积比为1 :4的比例在加入丙酮，混勻后，采用高效液相色谱法(HPLC)进行分析。流动相为乙腈水=18:82。流速为lml/min，进样量10 μ 1，可变波长检测器的工作波长为270nm，采用外标法按峰面积定量， 按照下列公式计算多菌灵降解率X 一，4—B..., “ A^ 式中，X为降解率，A为未接菌处理液中多菌灵浓度，B为接菌处理液中多菌灵浓度。该菌株14D内对多菌灵的降解率达到了 55. 47%，即14天降解了 554. 7mg,经条件优化，无机氮源替换成有机氮源(酵母粉，1. Og/L)，培养温度为28°C，初始pH6. 5，降解率达到了 63%，即多菌灵降解了大约630mg。实施例2.木霉Trl抑菌活性检测各种病原菌和木霉Trl在PDA培养基上培养三天后，用灭菌打孔器取带菌丝的圆盘型培养基块，将圆盘型带有病原菌的培养基块放距PDA平板中央1. 5cm处，将木霉Trl的培养基菌块放在距病原菌菌块3. 0 cm处，28°C下培养3天后记录抑菌带的宽度。计算木霉Trl 的抑菌率。实验中以市场上销售的木霉制剂LTR-2可湿性粉剂作为对照。上述病原菌为soIani, Phytophthora capsici, Verticillium dahliae YAeb, Phoma uvicola ^qyY,Bipolar is sorokiniana (Sacc. )hoemaker ,Fus本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一株具有多菌灵降解作用的生防木霉菌株（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）Ｔｒ１，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５２１０。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑恩泽，
申请(专利权)人：郑恩泽，
类型：发明
国别省市：88
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