本发明专利技术公开了一种海南捕鸟蛛毒素-XXI及其在制备镇痛消炎药物和制备研究TRPV1通道试剂中的应用。海南捕鸟蛛毒素-XXI(海南捕鸟蛛毒素-XXI)是由64个氨基酸残基组成的多肽,含有8个半胱氨酸及4对二硫键，其相对分子质量是6868.095。该毒素分子能激活辣椒素受体而对电压依赖性的各钠，钾通道亚型没有任何作用，显示良好的专一性，故该毒素分子具有开发成为研究TRPV1通道的良好工具试剂的潜在应用前景。此外该分子最大的特点就是能持续地激活TRPV1通道，使钙离子内流细胞长时间兴奋从而对外界刺激不再敏感，因此该分子具有镇痛消炎的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种海南捕鸟蛛毒素-XXI及其在制备镇痛药物中的应用和在制备研究TRPVl通道的良好工具试剂中的应用。
技术介绍
1997年成功克隆的辣椒素受体即TRPVl是近年来科学家们研究的“热点分子”， 它是机体内一个重要的伤害性感受分子，参与机体内众多生理和病理过程，并与某些疾病的发生有着密切的联系，因此TRPVl是许多新药研发的靶点分子(如镇痛药)。对该通道的研究主要集中在对它的激动剂和拮抗剂的筛选以及与它相关疾病机制方面的研究。由于辣椒素类物质的强烈刺激性，限制了这一类物质的临床应用，因此，开发刺激性小，水溶性强的辣椒素受体相互作用分子成为该通道新药研发的重要方向。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种专一性地激活辣椒素受体(TRPVl)通道的海南毒素-XXI。本专利技术提供的这种海南毒素-XXI (海南捕鸟蛛毒素-XXI)，其氨基酸序列如下 Ala Cys Ser Lys Gln lie Gly Asp Lys Cys Lys Arg Asn Cys Glu 151015Cys Cys Gly Lys Thr Val Val Cys Gly Thr lie Tyr Val Gly Gly 202530Lys Glu Val Asn Gln Cys Met Asp Lys Thr Ser Asp Asn Ala Ile 354045Lue Asn Gly Lue Gly Lys Gly Met Asn Phe lie Glu Asn Thr Phe 505560Ser Phe Cys Val0本专利技术涉及的海南捕鸟蛛毒素-XXI是由64个氨基酸残基组成的多肽，含有8个半胱氨酸及4对二硫键，其相对分子质量是6868. 095。该毒素分子的理化性质是纯化冻干的样品为白色疏松粉末，无气味，易溶解于水，水溶液近于无色透明；膜片钳电生理实验证明该毒素分子能激活辣椒素受体而对电压依赖性的各钠，钾通道亚型没有任何作用，显示良好的专一性，故该毒素分子具有开发成为研究TRPVl通道的良好工具试剂的潜在应用前景。此外，与其它已发现的激活剂相比较，该分子最大的特点就是能持续地激活TRPVl通道，使钙离子内流细胞长时间兴奋从而对外界刺激不再敏感，因此该分子具有镇痛消炎的效果。附图说明图1是海南捕鸟蛛粗毒的RP-HPLC色谱图，星号所标记的为目标分子所在的组份。图2是粗毒活性组份的进一步RP-HPLC (分析型)，箭头所示为海南捕鸟蛛毒素-XXI的色谱峰。图3是海南捕鸟蛛毒素-XXI的质谱鉴定图谱。图4是海南捕鸟蛛粗毒对辣椒素受体的激活作用。图5是海南捕鸟蛛毒素-XXI激活辣椒素受体，产生能被钌红阻断的钙电流，并呈现浓度依赖性。图6是海南捕鸟蛛毒素-XXI能持久地激活辣椒素受体。图7是海南捕鸟蛛毒素-XXI对TTX-R，Kv2. 1和Kv4. 2的抑制作用。具体实施例方式专利技术过程所涉及的材料，仪器，方法和结果(结合附图具体说明) 1.海南捕鸟蛛毒素-XXI的分离纯化，质谱鉴定及序列确定。1. 1粗毒采集在一个固定的铁架台上，用50 ml EP管作为毒液接收器，用大镊子从侧面夹住海南捕鸟蛛的腹部，使蜘蛛张开螯爪并伸入管中，然后用5 10 V的脉冲电压刺激两螯肢基部外侧3 5s。蜘蛛感受电刺激后，即用触肢紧紧抱住管壁，同时将螯爪有力刺向管内壁并射出毒液。毒液用微量注射器抽取收集后，放入_40°C冷冻干燥机中经真空冷冻干燥成浅黄色粉末即为粗毒。1.2反相HPLC分离纯化与制备每次称取50 mg海南捕鸟蛛粗毒粉末用10 ml Q水充分溶解，配置成5 mg/mL的粗毒样液，用IOOOOg的转速离心10 min后取上清液，然后用0. 22微米的过滤器进行过滤，上清液在Waters 515半制备型HPLC上分离纯化，每次上样5 mg左右的样品。在M87紫外检测器上以215 11!11和观0 nm两个波段检测，色谱柱为颗粒孔径10微米的反相柱，型号为 Phenomenex 10 X 250 mm C18 (10 mm)柱。以乙腈为流动相进行分离，梯度为(洗脱液 A 含 0. 1% TFA 的 ddH20 ；B 液含 0. 1% TFA 的乙腈，B 液 0%_20% 10 min, 30%-40% 24min ； 流速3.0 mL/min),柱温40°C，具体色谱图(如图1，215 nm)。图中星号所示为活性组份， 收取冻干目标峰在分析型2695 alliance色谱仪上进行进一步的分离纯化，2489检测器在215nm和280nm两个波段检测；色谱柱为颗粒孔径4微米的反相柱，型号为phenomenex Jupiter Proteo 10' 250謹；以乙腈为流动相(洗脱液A 含0. 1% TFA的ddH20 ；B液含 0.1% TFA 的乙腈，B 液 0%-30% 10 min, 30%-40% 10 min)，流速为 1.0 mL/min，柱温设定为 300C .其分析型色谱图(如图2，215nm)，箭头所示单一峰为海南捕鸟蛛毒素-XXI。1.3质谱鉴定经过第二轮分析型色谱分离的毒素样品冻干后为白色疏松粉末，无气味，易溶解于水，水溶液近于无色透明。应用MALDI-T0F/T0F(UltraFlex，德国Bruker公司)质谱鉴定其相对分子量。具体实验步骤用0.1 %三氟乙酸、50 %乙腈、50 % Q水混合液制备 CCA ( a -cyano-4-hydroxyc-innamic acid)基质液(5 mg/mL),充分混合后 IOOOOg 离心 10 分钟，然后分别取1 mL被测样品(可以直接是色谱仪上接收的样液)与4 mL CCA基质上清液混合，取1 mL混合液点样于质谱仪的样品板上，室温下自然风干后测定分子量。仪器工作环境线性模式、离子源加速电压是20kV、N2激光波长337nm、脉冲宽度3ns、离子延迟提取150ns、真空度4'10_7 Torr0质谱信号单次扫描累加50次，正离子测定模式，质谱结果使用外标(混合标准样品)校正。经测定其为单一组分并测得准确分子量为6868. 095 Da (如图3)，纯度在99%以上。1.4氨基酸序列确定海南捕鸟蛛毒素-XXI的测序是在491-A测序仪上完成的，它是利用了 Edman降解测序的原理通过偶联，环化裂解，转化三个步骤的循环来一个一个测定氨基酸的序列的。具体来说就是通过异硫氰酸苯脂(PITC)与蛋白质或者多肽的N-端残基的偶联，苯氨基硫甲酰酞 (PTC-肽)环化裂解，和噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)三个主要的化学步骤，每个循环从蛋白质或者多肽裂解一个氨基酸残基，然后暴露出新的游离的氨基酸以进行下一个Edman降解，最后通过每一轮的PTH-氨基酸鉴定实现蛋白质序列的测定。海南捕鸟蛛毒素-XXI经测定由64个氨基酸残基组成，含有8个半胱氨酸及其不常见的4对二硫键。经序列推断的分子量与质谱鉴定的分子量是相匹配的。为了进一步确定序列的准确性，我们设计引物从实验室已知海南捕鸟蛛文库中调出海南捕鸟蛛毒素-XXI的前体cDNA序列，经翻译后该分子前体总共由109个氨基酸构成，含有信号肽(18个氨基酸残基)，前导肽(27个氨基酸残基)，成熟肽(64个氨基酸残基，红色标记本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种海南捕鸟蛛毒素－ＸＸＩ，其特征是该捕鸟蛛毒素－ＸＸＩ的氨基酸序列如下：Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ１ ５１０ １５Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｕ ２０２５ ３０Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ ３５４０ ４５Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ ５０ ５５６０ 。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾雄智，梁宋平，陈仁忠，王贤纯，陈平，黄德雄，刘中华，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：43
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