本发明专利技术涉及一条编码精氨酸脱亚胺酶的优化DNA分子，以及含有所述的优化DNA分子的表达载体pET-30a-ADI，和含有所述表达载体的工程菌pET-30a-adi/BL21(DE3)，其保藏编号为：CGMCCNo.5199，本发明专利技术所述的工程菌菌株，具有高效表达精氨酸脱亚胺酶的效果，其表达率高达40%以上，纯化后比活在37℃可达110IU/mg。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一条编码ADI的优化DNA分子及含有所述优化DNA分子的工程菌，属于生物
技术介绍
L-精氨酸是哺乳动物细胞很重要的营养物质，它也被支原体用作主要的非糖酵解能量来源。从被支原体感染的细胞培养物中得到的精氨酸脱亚胺酶(Aiginine deiminase, ADI, EC 3.5.3.6)能够降解精氨酸为瓜氨酸和氨水，该酶存在于很多种类的微生物中，ADI 已被证明能够抑制肿瘤细胞体外生长以及具有抗血管生成的活性。人体正常细胞能够通过瓜氨酸透过胞质酵素精氨基琥珀酸合成酶(ASS)及精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)合成精氨酸。精氨酸的代谢途径已被很好地描述，在膳食摄取中，精氨酸从肝门静脉被肝吸收，并通过精氨酸酶迅速转化为鸟氨酸，在后一过程中，形成尿素，从精氨酸产生的鸟氨酸然后转化为瓜氨酸，或者可被代谢为谷氨酸盐/酯和丙氨酸，或者形成的鸟氨酸掺入多胺化合物，例如，腐胺。未被代谢为鸟氨酸的膳食精氨酸可被加工为例如精氨酰-tRNA，用于蛋白合成。此外，存在通向精氨酸的内源合成途径，后一过程主要在肾脏中发生，其中从鸟氨酸和瓜氨酸前体合成精氨酸。人形支原体M. arginini游ADI是一种能够降解精氨酸的酶，其由arcA基因编码，蛋白总量占I arginini可溶蛋白的10%，除了支原体I arginini以外，其它许多微生勉拟Mycoplasma hominis、Mycoplasma artkritidis、Mycobacterium tuberculosis、 Lymedisease spirochetes和Streptococcus等都编码ADI，后者催化精氨酸代谢为生物体提供能量。M. arginini编码的ADI是由410个氨基酸组成的球型生物大分子，分子量约为 46000，等电点为4. 7，没有分子内二硫键，以二聚体形式出现。氨基酸降解酶能通过解除胞外相关氨基酸的供给来抑制某些肿瘤细胞的增殖。人体部分肿瘤细胞缺乏精氨酸合成的相关酶，不能合成精氨酸(Cancer Res 62:5443-5440), 属于精氨酸营养缺陷型肿瘤细胞，这种不能表达精氨基琥珀酸合成酶的性质最近被科研人员所证实(Shen L J，Lin W C, Beloussow K, Shen W C. 2003)。肝癌、乳腺癌、黑素瘤等肿瘤是人体常见肿瘤，研究表明，这些肿瘤多是精氨酸营养缺陷型，这些肿瘤的细胞往往不能合成精氨酸，必须依赖外界的精氨酸来维持细胞的生长繁殖，而人体正常细胞是能够自身合成精氨酸的。因此，通过ADI降解血液循环中的精氨酸，精氨酸的营养缺陷导致肿瘤细胞增殖受到抑制，进而达到治疗肿瘤的效果。ADI能有效抑制精氨酸缺陷型肿瘤，如黑素瘤和肝细胞癌(HCC)的增殖。同时， ADI还能诱使人类白血病细胞的凋亡，抑制内皮细胞血管增生。1970年，Gill等人最先报道了从支原体分离得到的ADI能抑制小鼠淋巴瘤L5178Y细胞的分裂(Gill P, Pan J, 1970，16(6) :415—419)。小鼠体内研究表明，ADI注射在抑制黑素瘤和HCC实验鼠中是有效的(Takaku H, Takase M, 1992, 51 (2) :244-249)0然而，ADI用作常规抗肿瘤药物却因其低效性而受到限制，而这是由ADI作为一种微生物活性酶，在哺乳动物中具强抑制内皮细胞生长活性和较短的血清半衰期引起的。经20 KD PEG修饰ADI-PEG-20(ADI-SS PEG20, 00 mw)和天然ADI在体外对黑素瘤和HCC细胞一样有效。1999年ADI-PEG-20，即PEG化重组支原体ADI被FDA指定为美国罕见病药物，用于治疗恶性黑素瘤和HCC。目前正在全球范围进行治疗黑色素瘤和原发性肝癌的II期和III期临床试验。目前ADI在大肠杆菌中的高效重组表达仍然存在一定问题。尽管已有众多微生物可编码精氨酸脱酰酶，但在用微生物发酵生产ADI时，由于宿主菌目的蛋白普遍都存在表达量低的问题，一般宿主菌目的蛋白表达量在20%以下，目的蛋白表达量相对较高的如张希东，李捷雷等(张希东，李捷雷，张洪义，等.精氨酸脱亚胺酶的表达、纯化和活性研究 .中国生物工程杂志.2008，观(6):42、7.)在研究精氨酸脱亚胺酶的表达中，通过人工合成编码支原体精氨酸脱亚胺酶的基因，构建PBV220-ADI原核表达载体，并转染大肠杆菌DH5ci中并诱导表达目的蛋白，目的蛋白的表达量可达到30%以上。由于表达量低的问题，这严重制约着ADI的大规模工业化发展，因此，寻找可高效表达精氨酸脱亚胺酶的工程菌，以解决表达量低的问题，实现产业化生产，是本领域技术人员一直渴望解决的问题。
技术实现思路
本专利技术文本中，字母ADI用来表示精氨酸脱亚胺酶蛋白，表示蛋白ADI的表达基因。本专利技术的目的在于提供一条ADI编码基因的大肠杆菌密码子优化DNA分子adi, 其核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。本专利技术选用ai/i序列来源于人形支原体Mycoplasma hominis ATCC 23114全长1227个bps，共编码409个氨基酸，分子量为46313Da，等电点为 5 · 22ο本专利技术中，在优化基因时，通过优先突变基因在大肠杆菌中表达的稀有密码子选择五COli表达的最优密码子，并将携带优化的3办基因的表达载体转染至宿主菌后。通过序列优化，全基因合成ai/i序列，优化的ai/i只含有1个损ol和Mfe I酶切位点， 与表达载体连接后，ADI表达量占全菌总蛋白30%以上，优选35%以上。本专利技术的再一目的在于提供一种含有本专利技术优化DNA分子的表达载体，表达载体选用PET系列表达载体，采用带有T7启动子的高表达pET系列载体作为目的蛋白表达载体，构建的表达载体为pET30a-ai/i。本专利技术所构建的含优化adi序列的表达载体pET30a-ai/i，诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的30%，达到高效表达的目的，适合工业化规模生产。本专利技术的又一目的在于提供一株高效表达ADI的大肠埃希氏菌，所述大肠埃希氏菌是将构建的表达载体pET30a-ai/i转染至五coli BL21 (DE3)宿主菌中，转染至大肠杆菌后在含卡那抗性的LB平皿中帅选获得，该菌株已保藏至中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏日期2011年08月22日，建议的分类名为大肠埃希氏菌fecAericAia cWi，保藏编号为 CGMCC No. 5159。本专利技术的还一目的在于提供一种本专利技术所述的优化ai/i序列、以及含有本专利技术所述的优化的adi序列的表达载体pET30a-ai/i、和含有本专利技术构建的表达载体pET30a-ai/i的大肠埃希氏菌在生产制备精氨酸脱亚胺酶中的应用。在本专利技术的一个实施例中，给出了筛选本专利技术工程菌菌种的方法，通过筛选高表达量的阳性转化子，并将夺得的高表达量的阳性转化子(工程菌)进行保藏，其保藏编号为 CGMCC No. 5159。本专利技术的再一实施例中，给出了利用本专利技术工程菌发酵生产ADI的工艺， pET30a-ai/i/BL21 (DE3)工程菌表达的ADI占全菌比例高达46. 46%，高于目前已知文献中本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一条编码精氨酸脱亚胺酶的优化ＤＮＡ分子，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：侯建华，杨璐，
申请(专利权)人：北京凯因科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11
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