一种定量检测透明质酸片段结构变化的方法技术

本发明专利技术涉及一种对高分子透明质酸钠降解产生的透明质酸片段发生的结构变化进行定量检测的方法。其特点是分别采用高效液相色谱法和咔唑法同时测定透明质酸片段的含量，并利用其差值对不同方法制备的透明质酸片段的结构变化进行定量。本发明专利技术适用于各种方法制备的透明质酸片段，根据测定结果可评估降解方法对透明质酸结构的破坏程度及初步判断透明质酸片段的生产方法，是评价透明质酸片段质量的一种重要手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及透明质酸的测定方法，特别涉及。
技术介绍
透明质酸是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖组成的双糖单位重复连接而成一种直链高分子黏多糖。透明质酸片段一般为大分子透明质酸钠降解而成，其降解方法可分为三大类物理降解(例如加热、微波、超声波，射线等)、化学降解(例如酸、碱、氧化等)和生物降解(例如玻璃酸酶)。使用动物组织提取的玻璃酸酶降解透明质酸，只有酶切位点的糖苷键断裂，其双糖结构单元没有变化。但是在物理降解和化学降解过程中，透明质酸除了糖苷键的断裂，葡萄糖醛酸残基或乙酰氨基葡萄糖残基的结构也会发生变化。例如透明质酸在加热过程中产生双键，在碱降解过程中会发生脱乙酰基反应等。然而，透明质酸降解产生的透明质酸片段，是长短不一的透明质酸小分子片段的混合物，使用一般技术很难检测其结构的变化及变化程度。核磁共振技术(NMR)可用来测定物质结构，但这一技术对样品纯度要求很高，且仪器昂贵，检测费用很高，无法普及使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，可以对不同降解方法制备的透明质酸片段的结构变化进行定量分析。本专利技术是通过以下措施来实现的本专利技术涉及，其特征在于包括如下步骤1)将透明质酸片段用透明质酸酶酶解，然后采用高效液相色谱法测定透明质酸片段的含量；2)将透明质酸片段采用咔唑法测定透明质酸片段的含量；3)将步骤2)的测定值减去步骤1)的测定值，即为透明质酸片段结构变化的量。上述本专利技术的定量检测透明质酸片段结构变化的的方法，优选的，所述的步骤1) 包括以下步骤a)样品预处理精密称取透明质酸对照品和透明质酸片段样品适量分别置于50ml容量瓶中，用醋酸钠缓冲液溶解并定容，加入透明质酸酶，37°C水浴池；b)色谱条件在本专利技术的高效液相色谱测定中，采用糖分析柱；流动相为0. 5-1. 0 mol/L的磷酸盐缓冲液；流速为0. 3-1. 0 ml/min ；柱温为30士5°C ；检测波长235士5nm ；进样量为20 μ 1 ；c)结果计算采用高效液相色谱分别对对照品酶解液和样品酶解液进行色谱分离，按外标法以峰面积计算样品含量。本专利技术使用的透明质酸酶也称为玻璃酸酶，其降解透明质酸时，只有酶切位点的糖苷键断裂，其双糖结构单元没有变化。本专利技术使用透明质酸酶对样品进行预处理，并结合液相色谱分离技术得到样品含量，方法特异性高，而咔唑法的原理是只要样品中存在己糖醛酸结构即可与咔唑试剂发生显色反应，从而推算得到样品含量，特异性较差。这两种方法在测定大分子透明质酸钠和酶法生产的透明质酸片段含量时结果是一致的，但是在测定物理或化学方法制备的透明质酸片段的含量时，高效液相色谱法的测定值明显低于咔唑法的测定值。这是因为对于物理或化学方法制备的透明质酸片段，结构变化导致样品不能被完全酶解或发生结构变化的酶解产物不能在原保留时间被检测到；而咔唑法因为特异性差，测定结果不被样品的结构变化干扰。因此两种方法的差值可用于评估样品结构变化的程度。本专利技术中高效液相色谱法测定透明质酸片段含量特异性高，而咔唑法特异性差， 利用两者的测定差值可评估不同方法制备的透明质酸片段结构变化的程度，对透明质酸片段的生产和应用有一定的指导作用。具体实施例方式实施例1 1. 1样品动物组织提取的玻璃酸酶降解产生的透明质酸片段，平均分子量为5800。1.2 方法:a)样品预处理精密称取透明质酸对照品和透明质酸片段样品适量分别置于50ml容量瓶中，用醋酸钠缓冲液溶解并定容，加入透明质酸酶，37°C水浴池；b)色谱条件高效液相色谱法的色谱条件为氨基柱(4. 6mmX250mm)，流动相为0. 5 mol/L的磷酸钠缓冲液；流速为0. 5ml/min ；柱温为30°C;检测波长232nm ；进样量为20 μ L。咔唑法参照欧洲药典中透明质酸钠的含量测定方法。c)结果计算采用高效液相色谱分别对对照品酶解液和样品酶解液进行色谱分离，按外标法以峰面积计算样品含量。(以上的处理方法，实施例2-5与上基本相同)1.3结果咔唑法测定结果为92. 16%，高效液相色谱法测定结果为90. 85%，两者差值为1.31%，两种方法测定的结果无明显差异，说明透明质酸片段的结构变化小，即此方法对透明质酸结构的破坏作用小。实施例2:2.1样品盐酸降解产生的透明质酸片段，平均分子量为11600。2. 2方法高效液相色谱法的色谱条件为氨基柱(4. 6mmX 250mm)，流动相为0. 5 mol/L的磷酸钠缓冲液；流速为0. 5ml/min ；柱温为30°C;检测波长232nm ；进样量为20 μ 1。 咔唑法参照欧洲药典中透明质酸钠的含量测定方法。2. 3结果咔唑法测定结果为95. 99%，高效液相色谱法测定结果为77. 64%，两者差值为18. 35%，说明透明质酸片段的结构发生了变化，即盐酸降解对透明质酸结构有破坏作用。实施例3:3.1样品盐酸降解产生的透明质酸片段，平均分子量为7200。3. 2方法高效液相色谱法的色谱条件为氨基柱(4. 6mmX 250mm)，流动相为0. 5 mol/L的磷酸钠缓冲液；流速为0. 5ml/min ；柱温为30°C;检测波长232nm ；进样量为20 μ 1。 咔唑法参照欧洲药典中透明质酸钠的含量测定方法。3. 3结果咔唑法测定结果为95. 48%，高效液相色谱法测定结果为62. 38%，两者差值为33. 10%。结合实施例2的实验数据，说明在相同降解条件下，透明质酸片段的平均分子量越低，其结构破坏程度越严重。实施例4:4.1样品氧化降解产生的透明质酸片段，平均分子量为9600。4. 2方法高效液相色谱法的色谱条件为氨基柱(4. 6mmX 250mm)，流动相为0. 5 mol/L的磷酸钠缓冲液；流速为0. 5ml/min ；柱温为30°C;检测波长232nm ；进样量为20 μ 1。 咔唑法参照欧洲药典中透明质酸钠的含量测定方法。4. 3结果咔唑法测定结果为106. 4%，高效液相色谱法测定结果为67. 96%，两者差值为38.40%。说明氧化降解产生的透明质酸片段结构也发生了很大变化。实施例5 5.1样品氧化降解产生的透明质酸片段，平均分子量为2300。5. 2方法高效液相色谱法的色谱条件为氨基柱(4. 6mmX 250mm)，流动相为0. 5 mol/L的磷酸钠缓冲液；流速为0. 5ml/min ；柱温为30°C;检测波长232nm ；进样量为20 μ 1。 咔唑法参照欧洲药典中透明质酸钠的含量测定方法。5. 3结果咔唑法测定结果为103. 2%，高效液相色谱法测定结果为42. 14%，两者差值为61. 06%。结合实施例4的实验数据，说明在相同降解条件下，透明质酸片段的平均分子量越低，其结构破坏程度越严重。权利要求1.，其特征在于包括如下步骤1)将透明质酸片段用透明质酸酶酶解，然后采用高效液相色谱法测定透明质酸片段的含量；2)将透明质酸片段采用咔唑法测定透明质酸片段的含量；3)将步骤2)的测定值减去步骤1)的测定值，即为透明质酸片段结构变化的量。2.根据权利要求1所述的定量检测透明质酸片段结构变化的的方法，其特征在于所述的步骤1)包括以下步骤a)样品预处理精密称取透明质酸对照品和透明质酸片段样品适量分别置于50ml容量瓶中，用醋酸钠缓冲液溶解并定容，加入透本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．　　一种定量检测透明质酸片段结构变化的方法，其特征在于包括如下步骤：１）将透明质酸片段用透明质酸酶酶解，然后采用高效液相色谱法测定透明质酸片段的含量；２）将透明质酸片段采用咔唑法测定透明质酸片段的含量；３）将步骤２）的测定值减去步骤１）的测定值，即为透明质酸片段结构变化的量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王海英，郭学平，栾贻宏，刘爱华，
申请(专利权)人：山东福瑞达生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：88