本发明专利技术公开了一种植物内生真菌球毛壳菌株、微生物菌剂及其应用，这种菌株命名为球毛壳(Chaetomium?globosum)菌株ND35，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2010年10月09日，其保藏编号为CGMCC?No.4136。该菌株是一种具多种生防作用机制的生防益菌，具有广谱高效抑制植物病原菌和促进多种植物生长的能力，适合工业化生产，货架期长，适用于植物病害生物防治，可用于生产具有防治多种植物病害的生物杀菌剂产品和促进植物生长发育的多功能生物菌肥产品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业微生物领域，涉及的球毛壳(Chaetomium globosum)ND35菌株是一种具有多机制和广谱性抑制植物病原菌以及促进植物生长能力的植物内生真菌菌株，可用于研发具有防治多种植物病害的生物杀菌剂产品和促进植物生长的多功能生物菌肥产品
技术介绍
利用微生物活体菌剂防治植物病害是传统的生防技术之一，目前商品化的生防真菌主要是木霉菌等。虽然在生产上应用取得了一定的效果，但田间应用往往由于各种环境因素的影响而导致防病效果不稳定。其中主要原因是木霉菌的孢子粉制剂为其无性型分生孢子，容易失去活力，货架期较短，严重影响田间的生防效果。寻找生活力强、货架期长且具有生防机制多样性的新型高效生防菌株是当务之急。毛壳属真菌(Chaetomium spp.)是子囊菌重要属之一，球毛壳(CC. globosum)、 螺卷毛壳(C. cochliodes)、绳生毛壳(C. fun i Co la)和铜毛壳(C. cupreum)等能产生毛壳素、球毛壳素等多种抗生素，具有抗真菌和细菌活性(Brewer et al. , 1972 ；Di Pietro et al. , 1992 ；Aggarwal et al.，2004)。用毛壳处理种子或植物，可促进植物生长并获得高产。 能抑制20多属的植物病原真菌，包括引起农作物种子腐烂和种苗猝倒的腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌和引起蔬菜和大田作物以及林木、果树病害的灰霉病菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉、小麦颖枯病菌、大麦白粉病菌、稻瘟病菌、甘蔗红腐病菌、玉米弯孢叶斑病菌、杨树腐烂病菌、 苹果树腐烂病菌、苹果炭疽病菌等。在国外，已经用于苹果黑星病、欧洲赤松幼苗猝倒病等病害的田间生物防治试验(Cullen et al. , 1984 ；)。植物内生真菌是生活在植物体内，而不引起明显侵染症状的微生物。它们与植物长期协同进化是互惠共生的关系。已有的研究表明，在没有菌根真菌存在的环境中，内生真菌可以起到替代菌根真菌的促生防病作用。分离自健康毛白杨的内生真菌球毛壳ND35菌株是一个经过多年筛选研究得到的优良生防菌株。该菌株经诱导产生的粗酶液和抗生物质粗提液均能明显抑制多种植物病原真菌菌丝的生长和孢子萌发。扫描和透射电镜观察到， ND35能缠绕、侵入立枯丝核菌菌丝内部，降解细胞质。免疫细胞化学标记证明，几丁质酶和 β-1，3-葡聚糖酶在重寄生过程中起重要作用(Gao et al.，2005)。另外，球毛壳ND35菌株还能对杨树、核桃、板栗、番茄、黄瓜等植物的生长发育有明显的促进作用。毛壳菌在自然界广泛分布，具有广谱拮抗性和较强抗逆性。子囊孢子寿命长，对干燥、低温等不良环境的抵抗力强。子囊孢子在空气中干燥2. 5年，萌发率仍大于90% (刘晓光等，1999)。这一特性为延长活菌剂型生防产品的货架期提供了保证。因而，毛壳菌是一种理想的生防益菌。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服已有的生防菌株生活力不强，生防机制单一，货架期短而提供一种具有广谱高效抑制植物病原菌和促进多种植物生长的能力，适合工业化生产，货架期长，适用于植物病害生物防治的球毛壳(Chaetomium globosum)优良菌株。该菌株可用于生产具有促生防病功能的多种生防产品。为解决上述问题，本专利技术是通过如下技术方案实现的(一 )本专利技术的球毛壳真菌菌株1、本专利技术的球毛壳真菌菌株被命名为球毛壳(Chaetomium globosum)菌株ND35， 保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日2010年9月2日，保藏号为CGMCC No. 4136。其有性态属于子囊菌门、核菌纲、球壳目、毛壳科、毛壳属。2、本专利技术所述的球毛壳ND35菌株的培养特征本专利技术球毛壳ND35菌株分离自本地白杨树，菌株在马铃薯-葡萄糖琼脂培养基 (PDA)上培养，初期白色较浓密，后期淡褐色。在25°C条件下，5-6天菌落在PDA平板上扩展 9cm, 7天后从中心区域向外开始渐进产生子囊果，颜色逐渐变为橄榄绿色、橄榄褐色。15天后多个成熟子囊果聚集，密布整个PDA平板，在聚集的子囊果上方有肉眼可见稀疏辐射状的浅色菌丝覆盖(附图说明图1)。3、本专利技术所述的球毛壳ND35菌株的显微形态和超微结构特征子囊果表生，以褐色假根固着于基质表面，在反射光下为橄褐色、褐色、橄绿色， 卵形、近卵形、球形或近球形，偶见扁球形、倒卵形，直径140-320 μ m，高约160-370 μ m ； 子囊果壁由暗褐色或深褐色交错丝组织构成；顶生附属丝大量而密集，曲折状、波浪状或呈稍螺旋状卷曲，褐色，具隔，基部隔膜较明显，不分枝，表面具密集疣点，基部宽 3. 2-5. 2μπι;侧生附属丝，直立或稍曲折状，向顶渐细，分隔明显；子囊棍棒状或纺锤状， 具长柄，50-100X10-19 μ m，内含8个子囊孢子，子囊壁易消解；子囊孢子柠檬形，两侧扁， 两端各具一个细尖，偶见子囊孢子上有一个细尖状突起，幼时无色或浅色，成熟时褐色， 8-12 X 7-9 X 5. 3-7. 5 μ m，具单个顶生芽孔(图2)。扫描电镜下观察到，子囊壳顶端有孔口，其周围着生附属丝，附属丝基部具瘤状物。柠檬形的子囊孢子表面光滑，子囊孢子萌发时芽管从发芽孔向两端延伸(图3-4)。4、本专利技术所述的球毛壳ND35菌株的系统发育学鉴定提取该菌的DNA，以ITSl和ITS4为引物，通过PCR扩增出一段含有ITS1、5. 8S rDNA和ITS2的487bp的rDNA基因(NCBI登陆号EU164852)。测得的基因序列如序列表所示。将该序列进行 Blast 比较，与 Chaetomium globosumCg3、Cg4、Cg5、Cg8、Cg9、UAMH7142 和AFTOL-ID等菌株相似性达98-100 %。鉴定结果表明该菌株为球毛壳(Chaetomium globosum)，系统发育学与形态学的鉴定结果相同。( 二 )本专利技术球毛壳ND35菌株的孢子培养方法第一步球毛壳ND35菌株的子囊孢子产孢培养基组成马铃薯200g，葡萄糖20g， 琼脂18g，水1000ml，pH自然(不调整pH值)；第二步新鲜马铃薯去皮后切成边长0. 5cm的小方块，加水1000ml，煮沸后再加热 30min,然后用四层纱布过滤，保留滤液，加入20g葡萄糖，18g琼脂，定容至1000ml，121°C灭菌25min备用。第三步将活化的球毛壳ND35菌株的菌丝饼接种于PDA平板上，25°C培养12_15 天，可获得大量子囊孢子。经过一段时间的低温冷藏后，子囊孢子即可用1/2浓度的马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)配制成浓度为1 X IO6的孢子悬浮液用于固体菌剂培养的接种剂。(三)用本专利技术球毛壳ND35菌株液制备固体菌剂的方法第一步固体菌剂生产的原料可以利用小麦粒、玉米粒、大米粒、棉籽壳、粉碎的玉米秸、麦秸以及麦麸与蛭石混合物(体积比为1 1)和各种生产培养平菇、木耳、金针菇等食用菌的废料-菌糠等农副产品。第二步将第一步中的小麦粒等原料用自来水浸泡3-4小时，装入聚丙烯塑料袋中，两端用绳扎紧，121°C灭菌25min，凉透后从两端接入孢子浓度约为1 X IO6的子囊孢子悬浮液10m本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种植物内生真菌球毛壳菌株，其特征在于，其命名为球毛壳（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｇｌｏｂｏｓｕｍ）菌株ＮＤ３５，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：２０１０年１０月０９日，其保藏编号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４１３６。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高克祥，刘晓光，米士伟，毕建杰，张修国，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：37
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