针对烟草黑胫病的生防细菌及用量的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种针对烟草黑胫病的生防细菌及其用量的筛选方法，该方法包括以下步骤：a、在培养皿内滤纸上培养无菌烟苗，b、在步骤a的基础上，向培养皿中添加具有生防潜能的细菌培养液；c、待烟苗和具生防潜能的细菌菌悬液一起培养24小时后，向培养皿中添加烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液；d、在c步骤基础上，给予烟苗正常生长条件，7天后通过观察烟苗的发病情况来检测添加的具生防潜力细菌的防治效果，筛选出能够防治烟草黑胫病的生防细菌。本发明专利技术同传统方法相比，具有许多优点，它简便、快速、工作量少、高效、同时筛选结果准确可靠，可以在短暂的时间里从大量未知细菌中筛选出具有生防功能的细菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，属于作物病害生物防治

技术介绍
随着社会的发展，人们对吸烟给身体带来的危害越来越关注，对烟叶生产过程中化肥和农药的施用量的控制越来越强烈，大量的研究表明，烟草的许多病害可以通过生防细菌来防治；且利用生防细菌防治植物病害是今后发展的重点方向；生防细菌防治植物病害的一个难点是高效生防细菌的筛选。现有生防细菌菌株的选取往往通过以下步骤实现的，采用培养皿对峙培养法筛选具有抑菌圈效果的细菌，然后再活体盆栽验证其防病效果， 这种方法往往工作量大、速度慢、需要大量的试验材料和劳动量，其周期一般为90天以上， 严重制约了生防细菌菌株的选取。同时许多生防细菌在离体平板上对病原菌具有抑制效果，而在活体上却没有防治效果；而有一些拮抗细菌在活体上有很好的防治效果，而在离体平板上却没有活性，因此采用培养皿对峙培养法筛选拮抗细菌存在许多漏洞，有一定几率会使好的生防细菌遗失，不利于植物病害生物防治的发展。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种筛选准确率高、工作量小、速度快、成本低的针对烟草黑胫病菌的生物防治细菌及用量的筛选方法，可以克服现有技术的不足。本专利技术的技术方案是针对烟草黑胫病的生物防治细菌的筛选方法包括以下步骤a、在一组以上的培养皿内培养无菌烟苗，直至烟苗两片子叶完全展开；b、在步骤a的基础上，向培养皿中添加具有生防潜力的未知菌株培养液进行保护活性筛选；或在a步骤的基础上，向培养皿中添加烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液进行治疗活性筛选；C、待烟苗和具有生防潜力的未知菌株培养液一起培养M小时后，向培养皿中添加烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液；或待烟苗和烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液一起培养24 小时后，向培养皿中施加具有生防潜力的未知菌株培养液；d、在c步骤基础上，给予烟苗正常生长条件，7天后通过观察烟苗的发病情况来检测添加的具有生防潜力的未知菌株培养液的防治效果，选出能够防治烟草黑胫病的生防菌株。具有生防潜力的未知菌株是通过以下步骤得到的a、从烟草种植大田的烟草染病区域中选该区域中无染病烟株的土壤和烟叶；b、采用细菌传统NA培养基，从所选取的土壤、叶片中分离不同颜色、形态、生长速率的细菌，将这些细菌再次划线纯培养；c、b步骤所得单菌落菌株在NB液体培养基中震荡过夜得具有生防潜力的未知菌株。所用的培养皿直径为90mm。在每个培养皿中添加的烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液的数量为ImlX IO5个/ ml ο在得到生防菌株后，将其配成细菌菌悬液，并将浓度分别为10 Cfu-IO9 cfu的细菌菌悬液加入到烟苗培养皿中，7天后通过观察烟苗的发病情况来判断对最佳的生防菌株和生防细菌的最佳防病浓度。浓度为10 Cfu-IO9 cfu的生防细菌培养液按浓度被分为5-20份添加到烟苗培养皿中，通过防病效果来筛选得到最佳细菌用量。所述的生防细菌为可以为现有已知的化学杀菌剂。在培养皿中铺设有滤纸与现有技术比较，本专利技术通过在培养皿内滤纸上种植无菌烟苗作为生防细菌筛选的活体对象，这样就可利用活体对象直接对所选取的未知细菌是否具有生防效果进行筛选。同现有筛选方法相比，本法具有以下优点1、本筛选方法避免了培养皿对峙培养法筛选，这样不仅可以节约大量人力、物力和时间；而且可以避免一些在离体平板上没有效果，而在活体上有效果菌株的漏选；2、活体筛选在培养皿中的培养周期一般为7天，只需待两片子叶完全展开即可使用，相对现有的活体盆栽验证更加省时、省力，节约空间，且在培养皿中的活体生长环境可以更好的保持一致，使得试验数据更加准确；3、因活体烟苗是栽种在培养皿内滤纸上的，使得整个试验所需的空间大幅度减小，这样可以同时对多种生防细菌进行筛选，且每组可以有多个重复，进一步提高试验的准确性，可以在短暂的时间里筛选大量的未知细菌菌株；4、本方法筛选生防细菌所花费的时间为一般为20天左右，费用为10元左右， 相对现有的筛选方法可以节约时间70天，费用300元左右。在筛选出生防细菌后，对生防细菌的使用量也可直接采用活体进行测定，采用此方法选取合适的用量相对现有使用量筛选方法它简便、快速、工作量少、高效、同时筛选结果准确可靠，可以在短暂的时间对大量生防细菌的用量完成测试，且此方法也可以应用于化学杀菌剂用量的测定。具体实施例方式实施例1 以烟草黑胫病为例来详细说明本生防细菌的筛选，其步骤如下a、在一组以上的培养皿内滤纸上种植无菌烟苗，一组培养皿的数量一般为3个，每皿种植烟苗(品种红花大金元)12株，所用的培养皿直径为90mm，在培养皿中添加营养液，时间一般为5-7天，待烟苗两片子叶完全展开即可达到活体试验的标准；b、在得到活体试验用的烟苗后，向培养皿中添加具有生防潜力的未知菌株培养液进行保护活性筛选；具有生防潜力的未知菌株是通过以下步骤得到的(1)、从烟草种植大田的烟草染黑胫病区域中选该区域中无染黑胫病的烟株的土壤和烟叶；(2)、采用细菌传统NA培养基，从所选取的土壤、叶片中分离不同颜色、形态、生长速率的细菌，将这些细菌再次划线纯培养；(3)、(2)步骤所得单菌落菌株在NB液体培养基中震荡过夜得具有生防潜力的未知菌株。能够防治烟草黑胫病的细菌菌株的获得可在活体烟苗培养期间完成；C、待烟苗和具有生防潜力的未知菌株培养液一起培养M小时后，向培养皿中添加烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液，在每个培养皿中添加的烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液的数量为Iml X IO5个/ml。d、在c步骤基础上，给予烟苗正常生长条件，7天后通过观察烟苗的发病情况来检测施加的具有生防潜力的未知菌株的防治效果，筛选出防治烟草黑胫病的生防菌株。在得到烟草黑胫病的生防菌株后，在NB培养液中培养获得细菌悬浮液，并将浓度分别为10 Cfu-IO9 Cfu的细菌悬浮液添加到烟苗培养皿中，黑暗条件培养M小时后，在培养皿中添加烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液，7天后通过观察烟苗的发病情况来判断生防细菌的最佳防病浓度。为减少试验量，浓度为10 Cfu-IO9 cfu的生防细菌悬浮液按浓度可分为5-20份，如按9份来分，可将等体积的浓度为10、IO2、103、IO4、……IO9Cfu的生防细菌悬浮液加入到烟苗培养皿中，7天后确定效果最好的浓度范围。实施例2 以烟草黑胫病为例来详细说明化学杀菌剂甲霜灵防治此病害的浓度筛选，其步骤如下a、在一组以上的培养皿内滤纸上种植无菌烟苗，一组培养皿的数量为7个，每培养皿内种植12株烟苗，所用的培养皿直径为90mm，在培养皿中添加营养液，时间一般为5_7天， 待烟苗两片子叶完全展开即可用于药剂浓度的筛选；b、配制25、12. 5,6. 25,3. 125、1. 5625,0. 78、0mg/L 系列浓度的甲霜灵药液；向培养皿中施加带黑胫病病菌的游动孢子悬浮液；在每个培养皿中施加的烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液的数量为ImlX IO5个/升。C、向烟苗培养皿中添加Iml不同浓度的甲霜灵药液，待烟苗和药液一起培养12小时后，向培养皿内滤纸上添加Iml X IO5个/ml的烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液，上述条件下继续培养7天，通过观察烟苗的发病情况来检测不同浓度甲霜灵对烟草黑胫病的预防效果(保护活性测定)；待烟苗和带黑胫病病菌的游动孢子悬浮液一起培养24小时后，向培养皿中施加含本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种针对烟草黑胫病的生物防治细菌的筛选方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：ａ、在一组以上的培养皿内培养无菌烟苗，直至烟苗两片子叶完全展开；ｂ、在步骤ａ的基础上，向培养皿中添加具有生防潜力的未知菌株培养液进行保护活性筛选；或在ａ步骤的基础上，向培养皿中添加烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液进行治疗活性筛选；ｃ、待烟苗和具有生防潜力的未知菌株培养液一起培养２４小时后，向培养皿中添加烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液；或待烟苗和烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液一起培养２４小时后，向培养皿中施加具有生防潜力的未知菌株培养液；ｄ、在ｃ步骤基础上，给予烟苗正常生长条件，７天后通过观察烟苗的发病情况来检测添加的具有生防潜力的未知菌株培养液的防治效果，选出能够防治烟草黑胫病的生防菌株。

【技术特征摘要】
1.一种针对烟草黑胫病的生物防治细菌的筛选方法，其特征在于该方法包括以下步骤a、在一组以上的培养皿内培养无菌烟苗，直至烟苗两片子叶完全展开；b、在步骤a的基础上，向培养皿中添加具有生防潜力的未知菌株培养液进行保护活性筛选；或在a步骤的基础上，向培养皿中添加烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液进行治疗活性筛选；C、待烟苗和具有生防潜力的未知菌株培养液一起培养M小时后，向培养皿中添加烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液；或待烟苗和烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液一起培养M 小时后，向培养皿中施加具有生防潜力的未知菌株培养液；d、在c步骤基础上，给予烟苗正常生长条件，7天后通过观察烟苗的发病情况来检测添加的具有生防潜力的未知菌株培养液的防治效果，选出能够防治烟草黑胫病的生防菌株。2.根据权利要求1所述的针对烟草黑胫病的生物防治细菌的筛选方法，其特征在于 具有生防潜力的未知菌株是通过以下步骤得到的a、从烟草种植大田的烟草染病区域中选该区域中无染病烟株的土壤和烟叶；b、采用细菌传统NA培养基，从所选取的土壤、叶片中分离不同颜色、形态、生长速率的细菌，将这些细菌再次划线纯培养；c、b步骤所得单菌落菌株在NB液...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪汉成，石俊雄，李文红，夏海乾，王晶君，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究所，
类型：发明
国别省市：52