本发明专利技术涉及1，3-二羟基丙酮的合成，是将从酸性土壤分离和筛选的地衣芽孢杆菌B-05571，使用基因重组和DNA重排技术，将脱氢酶基因整合进大肠杆菌J?M?109，构建甘油脱氢合成1，3-二羟基丙酮的工业工程菌，并采用超分子自组装模板固定化，然后在含有甘油的培养基中发酵合成1，3-二羟基丙酮。通过过滤发酵液、有机溶剂萃取和组合溶剂重结晶等获得产品1，3-二羟基丙酮。合成工艺路线简捷，产品质量高和成本低，总质量收率达到75％以上。
【技术实现步骤摘要】
,3-二羟基丙酮的方法
本专利技术属于生物有机合成
，涉及1，3-二羟基丙酮的生物有机合成方法。
技术介绍
1，3_ 二羟基丙酮一种重要的化工、生化原料，医药、农药合成中间体和多功能食品添加剂，用途十分广泛。二羟基丙酮的合成方法主要有贵重金属催化氧化法和微生物法。重金属催化氧化甘油的合成法，由于无法克服催化选择性差的致命缺点，致使甘油转化率低于40 %，DHA的产率低于25 %。工业生产方法目前是利用微生物分批发酵。该法是在菌体生长到适当的时期，利用菌体产生的脱氢酶以甘油为底物进行脱氢反应，产生DHA。用于生产 DHA的微生物主要是醋酸杆菌属(AcetcAacter)和葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)微生物， 尤其是弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter Suboxy-dans)和氧化葡萄糖杆菌(Gluoonobacter Oxydans)。菌种在复苏后先进行预培养，然后转发酵罐扩大培养，待菌种达到一定浓度后， 接种到含有甘油的发酵培养基当中，经过60-80h的耗氧发酵后，再将发酵液一次放出，经分离纯化得到DHA。每一个分批发酵过程都经历接种、生长繁殖、菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。目前已有采用分流加甘油方法，在菌体生长到对数期时，并在产物DHA达到一定水平后，放出部分产物，并补加原料和培养基，这样就可以减少达到生产水平的生物量的时间，提高底物甘油的利用率，节约成本。分批发酵的特点是微生物所处的环境是不断变化的，发生杂菌污染，能够很容易终止操作。在发酵生产中，使用的菌种处于对数生长期，把它们接种到发酵罐新鲜培养基时，几乎不出现调整期，这样可在短时间内获得大量生长旺盛的菌体，有利于缩短生产周期。但该法的主要问题是底物甘油和产物DHA在培养基中的浓度过高时产生了高渗透压，使得发酵菌体裂解、失活，从而导致DHA的产率难以提高。本专利技术是将从酸性土壤分离和筛选的地衣芽孢杆菌B-05571，使用基因重组和DNA重排技术， 将脱氢酶基因整合进大肠杆菌J M 109，构建甘油脱氢合成1，3_ 二羟基丙酮的工业工程菌，并采用超分子自组装模板固定化，然后在含有甘油的培养基中发酵合成1，3-二羟基丙酮。通过过滤发酵液、有机溶剂萃取和组合溶剂重结晶等获得产品1，3-二羟基丙酮。合成工艺路线简捷，既节能又环保，所获得的产品质量高和成本低，总质量收率达到75%以上。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种合成，3_ 二羟基丙酮的方法，是将从酸性土壤分离和筛选的地衣芽孢杆菌B-05571，使用基因重组和DNA重排技术，将脱氢酶基因整合进大肠杆菌J M 109，构建甘油脱氢合成1，3-二羟基丙酮的工业工程菌，并采用超分子自组装模板固定化，然后在含有甘油的培养基中发酵合成1，3_ 二羟基丙酮。通过过滤发酵液、有机溶剂萃取和组合溶剂重结晶等获得产品1，3-二羟基丙酮。本专利技术通过下述方法实现的地衣芽孢杆菌分离培养基蒸馏水IOOOmL,甘油5g，NaCl 5g，酵母粉5g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，调pH7. 0，0. IMPa灭菌20min.冷却至 45°C，加入尼尔红(NileRed) 2mL/L(0. 30mg Nile Red溶于IOOmL 二甲基亚砜)，无菌条件下倒入培养皿，冷却后备用。富营养培养基蒸馏水IOOOmL,酵母粉10g，琼脂粉10g，甘油3g，(NH4) 2S045g,调 ρΗ7· 0,0. IMPa 灭菌 IOmin.产品发酵培养基磷酸盐缓冲液的配制蒸馏水lOOOmL，NaH2PO4. 12H20 8. 95g，KH2PO4L 5g， ρΗ7· 00. IMPa 灭菌，15min 20min,备用。基因工稈菌富集培养基为LB培养基发酵培养基为添加15. 0%甘油的LB培养基，以鼓入空气作为基因工程菌氧化剂；培养温度为35°C。地衣芽孢杆菌B-05571发酵及DHA的提取甘油发酵前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml富营养培养基，以无菌牙签接入地衣芽孢杆菌B-05571的单菌落。35°C、120r/min培养15h。将前培养物0. 5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，30°C、130r/min振荡培养Mh。4°C，6000*g 无菌离心lOmin，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混勻，然后在4°C，6000 无菌离心12min，弃上清。将前培养物0. 5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，35°C、130r/min振荡培养Mh。4°C，6000 无菌离心lOmin，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混勻，再次在4°C ,6000 无菌离心12min，弃上清。将超分子自组装模版 3g加入其中，在20 25°C下进行固定化池。在分别将不含有富营养培养基的菌体无菌接入10瓶含有IOOrn发酵培养基的500ml三角瓶中，30°C、130r/min振荡培养72h。发酵产物的分离发酵收获后，离心分离和回收催化酶，发酵母液使用乙酸丁酯萃取，将萃取所得的有机浓缩后，使用乙酸丁酯和石油醚(1 4体积)重结晶得到产品。具体实施例方式下面结合具体的实施例，对本专利技术作进一步的阐述，但不限于这些具体的实施例， 而所有的实施例均按上述的操作步骤操作。实施例1地衣芽孢杆菌分离培养基蒸馏水lOOOmL，甘油5g，NaCl 5g，酵母粉5g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，调pH7. 0，0. IMPa灭菌20min.冷却至 45°C，加入尼尔红(Nile Red) 2mL/L(0. 30mg Nile Red溶于IOOmL 二甲基亚砜)，无菌条件下倒入培养皿，冷却后备用。富营养培养基:蒸馏水lOOOmL，酵母粉10g，琼脂粉10g，甘油3g，(NH4) 2S045g，调 ρΗ7· 0,0. IMPa 灭菌 lOmin.产品发酵培养基磷酸盐缓冲液的配制蒸馏水lOOOmL，NaH2PO4. 12H20 8. 95g，KH2PO4L 5g， ρΗ7· 00. IMPa 灭菌，15min 20min,备用。基因工程菌富集培养基为LB培养基发酵培养基为添加15.0%甘油的LB培养基，以鼓入空气作为基因工程菌氧化剂；培养温度为35°C。地衣芽孢杆菌B-05571发酵及DHA的提取甘油发酵前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml富营养培养基，以无菌牙签接入地衣芽孢杆菌B-05571的单菌落。35°C、120r/min培养15h。将前培养物0. 5ml接种至含有IOOml富营养培养基的500ml三角瓶中，30°C、130r/min振荡培养Mh。4°C，6000*g 无菌离心lOmin，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混勻，然后在4°C，6000 无菌离心12min，弃上清。将前培养物0. 5ml接种至含有IOOml富营养培养基的500ml三角瓶中，35°C、130r/min振荡培养Mh。4°C，6000 无菌离心lOmin，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混勻，再次在4°C ,6000 无菌离心12min，弃上清。将超分子自组装模版 4g加入其中，在20 25°C下进行固定化4h。分别将不含有富营养培养基的菌体无菌接入 10瓶含有200m发酵培养基的5本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．本专利技术涉及１，３－二羟基丙酮的合成，是将从酸性土壤分离和筛选的地衣芽孢杆菌Ｂ－０５５７１，使用基因重组和ＤＮＡ重排技术，将脱氢酶基因整合进大肠杆菌ＪＭ１０９，构建甘油脱氢合成１，３－二羟基丙酮的工业工程菌，并采用超分子自组装模板固定化，然后在含有甘油的培养基中发酵合成１，３－二羟基丙酮。通过过滤发酵液、有机溶剂萃取和组合溶剂重结晶等获得产品１，３－二羟基丙酮。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：傅尧，郭庆祥，曹文化，封立刚，腾道路，邓晋，赵红，李玉玲，徐清，张颖，
申请(专利权)人：徐州恒源生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。