运用双重PCR引物检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌的方法技术

本发明专利技术涉及使用PCR扩增技术检测禾草腥黑粉菌(TilletiafuscaEⅡ&EⅤ)和雀麦腥黑粉菌[T.bromi(Brockm.)Brockm]的方法，属于禾本科草种腥黑粉菌检测领域。本发明专利技术设计了6套引物，即通用外套引物、通用内套引物、T.fusca的外套引物和特异引物、T.bromi的外套引物和特异引物。通用外套引物用于菌丝基因组DNA或冬孢子的套式扩增，通用内套引物用于冬孢子的套式扩增，这两套引物用于扩增过程质量监测，检查所抽提的菌丝基因组DNA质量和冬孢子的挑取和破碎，避免检测过程中的假阴性。T.fusca和T.bromi的外套引物和特异引物可用于两种菌的菌丝基因组DNA双重特异PCR扩增，各自的外套引物与特异引物用于双重套式PCR特异扩增冬孢子DNA。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及使用PCR技术检测寄生于禾本科草种中禾草腥黑粉菌(7 fusca E II & E V )和雀麦腥黑粉菌的方法，属于禾本科草种腥黑粉菌检测领域。
技术介绍
早熟禾属(/^3L )植物中的许多种是优质的牧草和草坪草，在全国各地广泛种植， 以满足畜牧业及城市园林绿化建设的需要。草地早熟禾A pratensis L.的再生能力强， 抗寒性和秋季保绿性较好；加拿大早熟禾A compressaL.具发达的根系和根状茎，耐寒、 耐土壤干旱、耐瘠薄的能力优；一年生早熟禾A annua L.喜光，耐阴、耐旱性强，耐瘠薄 (谢可军等.10种早熟禾属植物的过氧化物酶同工酶分析.中国草地，2003，25(2): 30-33 )。目前，在进境禾本科草种中，早熟禾数量最多，每年约有2000多吨被引入中国。优良草种的引进，一定程度上促进了畜牧业的发展和改善了城市的环境水平，产生了较好的经济效益和社会效益。但同时，随着国外草籽的大量引进，外来危险性有害生物也随草籽进入，对我国城市园林绿化建设及农牧业生产安全造成潜在威胁。龚贤弟等(六月禾腥黑穗病菌的初步研究.植物检疫，，1991，5(6): 407-411)和李鸣等(从美国进口六月禾中检出狐草腥黑穗病菌.植物检疫，1992，6(6): 42)报道，从进境草地早熟禾即六月禾0°. /Trateasil5)中发现一种冬孢子形态与雀麦上的TYBeiia bromi (Brockm.) Brockm.、乌尔波草上的(7 /i/sca E II & E V)、早熟禾中的 7 sterilis 私 T. togwateei 相似的腥黑粉菌。随后，天津出入境检验检疫局多次从来自美国的草地早熟禾、一年生早熟禾和加拿大早熟禾的种子中截获此菌。腥黑粉菌riBeiia Tul. & C. Tul.引起的腥黑穗病是早熟禾上重要的真菌病害， 严重影响早熟禾的品质和产量。Mof^iJilletia puccinelliae, a new species of reticulate-spored bunt fungus infecting Puccinellia distans. Mycologia, 2010, 102(3) : 613-623)认为，侵染早熟禾属的腥黑粉菌有6种7 cathcartae Duran & G. W. Fisch.、T. paradoxa Jacz.、Τ. poae Nagorny> Τ. sterilis Ule、Τ. togwateei 禾口 Τ. transiliensis Μ. N. Kusnezow & Schwarzman.。其中，Τ1· paradoxa > Τ. transiIiensis 和Τ. cathcartae的冬孢子表面具瘤突，其它3种表面纹饰网状-’T. sterilis的冬孢子堆聚生于叶鞘和茎部，其它种则危害子房，将种子变为菌瘿(Durto R et al. , The genus Tilletia. Pullman Press, Washington. , 1961, 138)。就寄主范围而论，T1. togwateei Poareflexa Vasey & Scribn (Guillemette MK et al.， a new bunt species from Poa reflexa. Mycologia, 1988，80(3) : 273-285), T. /？彻没寄生于林地早熟禾户.nemoralis L.。依据 Guillemette (Guillemette MK. Tilletia togwatii, a new bunt species from Poa refIexa. Mycologia, 1988, 80 (3) : 273—285)、Boyd (Boyd ML et al.， Molecular relationships among varieties of the Tilletia fusca(71. bromi) complex and related species. Mycological Research, 1997, 101 (3): 269-277)； Boyd ML et al. , Evidence supporting the separation of the Vulpia- and Bromus-infecting isolates in the Tilletia fusca (T. bromi) complex. Mycologia, 1998， 90(6): 1031-1039)禾口 Vanky (Vanky K. European smut fungi. Gustav Fischer Verlag Press, Germany. 1994，570)的分类观点，7和 7力寄主不包括早熟禾属，那么，从早熟禾中发现的类似7 ⑵和7力的腥黑粉菌之分类地位及有关特性需要进一步明确。罗加凤(罗加凤等，从进口早熟禾种子中检出的一种腥黑粉菌与其近似种的比较.菌物学报，2011，30(1): 32-38)根据3种早熟禾上截获的腥黑粉菌与4 种近似种基于菌瘿、冬孢子形态及萌发生理特性的比较，将早熟禾上的腥黑粉菌定名为7 bromi 0但是长期以来检疫系统一直将早熟禾上发现的这种腥黑粉菌鉴定为禾草腥黑穗病菌7 /iAsca (龚贤弟等，六月禾腥黑穗病菌的初步研究.植物检疫，1991，5(6): 407-411;王圆.中国进境植物检疫有害生物选编，北京中国农业出版社，1997， 505-506)，而且T. bromi和T. fusca之间冬孢子形态及萌发生理特性非常相似(罗加凤等，从进口早熟禾种子中检出的一种腥黑粉菌与其近似种的比较.菌物学报，2011， 30(1): 32-38. ),Boyd 等(Boyd ML et al. , Molecular relationships among varieties of the Tilletia fusca (T. bromi) complex and related species. Mycological Research, 1997, 101(3): 269-277; Boyd ML et al., Evidence supporting the separation of the Vulpia- and Bromus-infecting isolates in the Tilletia fusca (T. bromi) complex. Mycologia, 1998，90(6): 1031-1039)从寄主专化性、分子生物学及细胞学三方面阐述了侵染Vulpia的专化型和侵染Io^as的专化型的不同，将集合种分为两个独立的种，T. ZiAsca和7 bromi -’\k为T. /i/sca寄主仅限于fe7/7ia，而将侵染雀麦的腥黑粉菌归为7力ro i。腥黑粉菌属主要依据形态学、萌发生理、细胞学诸方面的特性以及寄主专化性这些传统方法进行分类，但萌发实验耗时费力，萌发是否成本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种运用双重ＰＣＲ引物检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌的方法，既能对菌丝基因组ＤＮＡ实现双重特异ＰＣＲ检测，又能对冬孢子实现双重套式ＰＣＲ检测，其特征在于，所设计的引物和用途如下：（１）设计腥黑粉菌属通用引物，序列如下：通用外套引物：ＩＧＳＵＦ１：ＧＧＡ　ＴＧＣ　ＡＴＴ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＡＣＧ　ＴＩＧＳＵＲ１：ＧＴＡ　ＧＣＣ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＣＴＡ　ＣＧＡ　ＴＣＴ　Ｇ通用内套引物：ＮＩＧＳＵＦ１：ＣＡＣ　ＣＧＣ　ＣＣＡ　ＡＧＣ　ＡＣＧ　ＴＡＣＮＩＧＳＵＲ１：ＧＡＣ　ＣＴＴＴＴＧ　ＧＧＧ　ＴＣＡ　ＡＡＣ　ＴＴＣ　ＴＣ通用外套引物用于腥黑粉菌属菌丝基因组ＤＮＡ或冬孢子套式扩增，扩增片段约为９００ｂｐ，通用内套引物用于冬孢子的套式扩增，扩增片段约为７００ｂｐ，这两套引物用于腥黑粉菌属扩增过程质量监测，检查所抽提的菌丝基因组ＤＮＡ质量和冬孢子的挑取和破碎，避免检测过程中的假阴性；（２）设计禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌各自的外套引物和特异引物，序列如下：禾草腥黑粉菌的外套引物：ＩＧＳＵＦ２：ＧＡＧ　ＣＧＡ　ＴＡＣ　ＣＴＴ　ＴＧＣ　ＡＴＴ　ＣＴＧ　ＡＣＧＴＩＧＳＵＲ２：ＣＡＣ　ＴＧＣ　ＡＴＴ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＡＣＧ　ＴＡＣ禾草腥黑粉菌的特异引物：ＰＦＳＦ：ＧＡＣ　ＴＣＧ　ＣＧＴ　ＣＡＡ　ＧＣＧ　ＡＰＦＳＲ：ＧＣＧ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＡＡＧ　ＴＴＣ　ＧＡＣ，特异引物的扩增片段约为１４０ｂｐ，这两套引物用于禾草腥黑粉菌的菌丝基因组ＤＮＡ特异ＰＣＲ扩增和冬孢子套式ＰＣＲ的扩增，雀麦腥黑粉菌外套引物：ｔｕｂＦ：ＧＡＡ　ＧＡＣ　ＧＴＡ　ＴＧＣ　ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＧＡｔｕｂＲ：ＡＧＧ　ＡＧＧ　ＡＴＧ　ＣＣＧ　ＡＧＣ　ＧＡＧ　Ａ雀麦腥黑粉菌特异引物：ＰＮＳＦ：ＣＴＣ　ＡＡＣ　ＣＣＴ　ＴＣＣ　ＣＴＣ　ＴＡＴ　ＴＣＣＰＮＳＲ：ＣＧＡ　ＴＡＣ　ＧＧＡ　ＴＴＣ　ＴＧＣ　ＡＴＴ　ＣＣ特异引物的扩增片段约为４２０ｂｐ，这两套引物用于雀麦腥黑粉菌的菌丝基因组ＤＮＡ特异ＰＣＲ扩增和冬孢子套式ＰＣＲ的扩增。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗加凤，廖芳，刘跃庭，刘鹏，张裕君，黄国明，
申请(专利权)人：天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：12