本发明专利技术公开了用于检测鱼类免疫因子水平的试剂盒。本发明专利技术的用于检测鱼中免疫因子的引物组合物，由如下引物对组成：用于扩增TNF-α的引物对1：SEQ?ID?NO：1所示引物和SEQ?ID?NO：2所示引物；用于扩增IL-1β的引物对2：SEQ?ID?NO：3所示引物和SEQ?ID?NO：4所示引物；用于扩增HSP70的引物对3：SEQ?ID?NO：5所示引物和SEQ?ID?NO：6所示引物；用于扩增TGF-β的引物对3：SEQ?ID?NO：7所示引物和SEQ?ID?NO：8所示引物。本发明专利技术的用于实时定量PCR检测鱼类免疫因子体系的引物，具有特异性好、无干扰背景的特点。本发明专利技术中的鱼类饲料组合物可以提高鱼的免疫因子的表达量。因此，本发明专利技术在提高鱼的免疫能力及检测鱼的免疫系统领域具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于检测鱼类免疫因子水平的试剂盒。
技术介绍
细胞因子(cytokine)是由免疫系统细胞以及其他类型细胞主动分泌的一类小分子量的可溶性蛋白质，包括淋巴因子、干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、趋势化因子和集落刺激因子等。细胞因子是免疫系统细胞间，以及免疫系统细胞与其他类型细胞间联络的核心， 能改变分泌细胞自身或其他细胞的行为或性质，通过与细胞特异的膜受体而起作用。鱼类通过免疫系统抵抗外界病原微生物的侵害，实现自身的免疫保护。与高等脊椎动物一样，鱼类免疫系统中也存在许多细胞因子，它们行使非特异性和特异性免疫防御， 在维持机体内环境的稳定方面发挥重要作用。目前在鱼类中发现多种细胞因子的存在，并且利用分子生物学技术，已经克隆到部分细胞因子的基因。实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光化学物质基团，通过荧光定量 PCR仪实时、自动监测整个PCR扩增过程中荧光信号的积累，检测PCR扩增产物及对未知模板进行定量分析的方法。在整个PCR实验中，所有反应均在同一体系中进行，而且不需要任何后处理过程。荧光信号的产生和检测与PCR扩增过程密切相关，被测产物的数量与起始模板拷贝数直接相关，可以通过测量每次循环产生的荧光信号强度，并参照对照基因的标准曲线来定量。实时荧光定量PCR具有灵敏度高、实时检测、污染少、操作简单方便、安全等优点，已被广泛应用于基因表达量的研究中。实时荧光定量PCR分标准曲线定量(绝对定量)和采用内标物作参照(相对定量)。标准曲线定量是采用已知物的标准曲线(5倍、10倍等系列稀释)用来定量未知目的物。相对定量的方法用目的基因与对照基因进行样品间的比较。通过目的基因的Ct减去对照基因Ct获得相对于对照基因的定量数据，循环数差别是基数2的指数，表示这两个基因的倍数差别。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供三种用于检测免疫因子表达量的试剂盒及三种用于检测免疫因子表达量的实时荧光定量PCR试剂。第一种用于检测免疫因子表达量的试剂盒，由如下引物对组成用于扩增TNF-α的引物对1 =SEQ ID NO 1所示引物和SEQ ID NO 2所示引物；用于扩增IL-I β的引物对2 =SEQ ID NO 3所示引物和SEQ ID NO 4所示引物；用于扩增HSP70的引物对3 =SEQ ID NO 5所示引物和SEQ ID NO 6所示引物；用于扩增TGF-β的引物对4:SEQ ID NO :7所示引物和SEQ ID NO :8所示引物。上述第一种试剂盒中，所述免疫因子为鱼的免疫因子，具体为罗非鱼的免疫因子；所述免疫因子为TNF-α、IL-I β、HSP70 和 TGF-β。第一种用于检测免疫因子表达量的实时荧光定量PCR试剂，由如下试剂1至4组成，每种试剂均独立包装；PCR试剂1组成每18ul PCR试剂1由1 μ L浓度为4 μ M的SEQ ID NO: 1所示引物溶液、IyL浓度为4μ M的SEQ ID NO :2所示引物溶液、10 μ L实时荧光定量PCR缓冲液组成和6 μ L ddH20组成；PCR试剂2组成除引物为SEQ ID NO 余均与所述PCR试剂1相同；PCR试剂3组成除引物为SEQ ID NO 余均与所述PCR试剂1相同；PCR试剂4组成除引物为SEQ ID NO 余均与所述PCR试剂1相同。上述第一种实时荧光定量PCR试剂，所述免疫因子为鱼的免疫因子，具体为罗非鱼的免疫因子；所述免疫因子为TNF- α、IL-I β、HSP70和TGF- β。第二种用于检测免疫因子表达量的试剂盒，由如下引物对组成用于扩增TNF-α的引物对1，为如下1)和/或2)1)SEQ ID NO 1所示引物和SEQ ID NO 2所示引物；2) SEQ ID NO 13 所示引物和 SEQ ID NO 14 所示引物；用于扩增IL-I β的引物对2，为如下1)和/或2)1) =SEQ ID NO 3 所示引物和 SEQ ID NO 4 所示引物；2) =SEQ ID NO 9 所示引物和 SEQ ID NO 10 所示引物；用于扩增HSP70的引物对3，为如下1)和/或2)所示1)SEQ ID NO 5所示引物和SEQ ID NO 6所示引物；2) SEQ ID NO 15 所示引物和 SEQ ID NO 16 所示引物；用于扩增TGF-β的引物对4，为如下1)和/或2)所示1)SEQ ID NO 7所示引物和SEQ ID NO 8所示引物；2) SEQ ID NO 17 所示引物和 SEQ ID NO 18 所示引物；用于扩增IL-10的引物对5，SEQ ID NO 11所示引物和SEQ ID NO 12所示引物。第二种用于检测免疫因子表达量的实时荧光定量PCR试剂，由如下试剂1至9组成，每种试剂均独立包装；PCR试剂1组成每18ul PCR试剂1由1 μ L浓度为4 μ M的SEQ ID Ν0:1所示引物溶液、IyL浓度为4μ M的SEQ ID NO :2所示引物溶液、10 μ L实时荧光定量PCR缓冲液组成和6 μ L ddH20组成；PCR试剂2组成除引物为SEQ ID NO :3所示引物和SEQ ID NO :4所示引物外，其余均与所述PCR试剂1相同；PCR试剂3组成除引物为SEQ ID NO :5所示引物和SEQ ID NO :6所示引物外，其余均与所述PCR试剂1相同；PCR试剂4组成除引物为SEQ ID NO :7所示引物和SEQ ID NO :8所示引物外，其余均与所述PCR试剂1相同；PCR试剂5组成除引物为SEQ ID NO 9所示引物和SEQ ID NO 10所示引物外，:3所示引物和SEQ ID NO :4所示引物外，其 :5所示引物和SEQ ID NO :6所示引物外，其 :7所示引物和SEQ ID NO :8所示引物外，其其余均与所述PCR试剂1相同；PCR试剂6组成除引物为SEQ ID 其余均与所述PCR试剂1相同；PCR试剂7组成除引物为SEQ ID 其余均与所述PCR试剂1相同；PCR试剂8组成除引物为SEQ ID 其余均与所述PCR试剂1相同；PCR试剂9组成除引物为SEQ ID 其余均与所述PCR试剂1相同。上述第二种试剂盒或第二种实时荧光定量PCR试剂，所述免疫因子为鱼的免疫因子，具体为罗非鱼的免疫因子或锦鲤的免疫因子的免疫因子；所述免疫因子为TNF-α、IL-1 β、HSP70、TGF_3 和 IL-10。第三种用于检测免疫因子表达量的试剂盒，由如下引物对组成用于扩增TNF-α的引物对1，为如下1)、2)和3)中的至少一种1)SEQ ID NO 1所示引物和SEQ ID NO 2所示引物；2) SEQ ID NO 13 所示引物和 SEQ ID NO 14 所示引物；3) SEQ ID NO 19 所示引物和 SEQ ID NO 20 所示引物；用于扩增IL-I β的引物对2，为如下1)、2)和3)中的至少一种1) =SEQ ID NO 3 所示引物和 SEQ ID NO 4 所示引物；2) =SEQ ID NO 9 所示引物和 SEQ ID NO 10 所示引物；3) =SEQ ID NO 21 所示引物和 SEQ ID NO 22 所示引物；用于本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于检测免疫因子表达量的试剂盒，由如下引物对组成：用于扩增ＴＮＦ－α的引物对１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示引物和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示引物；用于扩增ＩＬ－１β的引物对２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示引物和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所示引物；用于扩增ＨＳＰ７０的引物对３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５所示引物和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６所示引物；用于扩增ＴＧＦ－β的引物对４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７所示引物和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８所示引物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周志刚，曹雅男，毛玮，姚斌，何夙旭，徐俐，孟昆，杨培龙，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：11
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