用于修复周围神经缺损的缓释组织工程支架复合体及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种用于周围神经缺损修复与重建的缓释组织工程神经支架复合体及其制备方法。该复合体是由壳聚糖、琼脂糖及神经生长因子按其制备方法构建而成，在人体内可吸收降解，无毒无害，价格低廉。可以明显促进神经再生，克服了原有单纯导管的各种弊端，其治疗效果基本达到了自体神经移植水平。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是属于一种用于神经缺损后修复与再生的缓释组织工程支架复合体，特别涉及用于神经桥接术支架内作为促神经生长的各种因子载体的填充材料及其制备方法。
技术介绍
周围神经缺损的修复一直是困扰临床的一个难题。传统的修复方法如外膜缝合其疗效优良率仅为50％，应用精细的显微外科技术行束膜缝合，也难以避免地发生神经束的错接，神经功能恢复受到影响。通常为保证在无张力下缝合，一般在神经缺损3cm以上就要进行神经移植。自体神经移植至今仍是公认的修复神经缺损的黄金标准。但这种“拆东墙补西墙”的治疗手段，不仅会造成新的创伤如供区感觉、运动障碍，而且尚有许多难以逾越的困难存在。异体神经移植因免疫排斥反应问题仍未解决，所以不能用于临床。为进一步提高修复效果，人们从神经细胞学、分子生物学水平对周围神经再生进行了深入的研究。特别是组织工程学的开展为从根本上解决组织器官的修复与重建带来了希望。随之提出的人工神经作为一种崭新的神经缺损修复材料，要求具有良好生物相容性的载体与有活性的因子结合，形成具有特定三维结构的生物活性复合体。即人工神经应具备1.可接纳再生轴突长入并起引导作用的支架——神经导管；2.活性细胞在神经导管内有序分布并具有生物活性能分泌营养因子。作为早期工作，近十余年来国内外学者对应用生物材料制成的神经导管替代自体神经修复N缺损高度重视，证实了其可行性。在论证了神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)在体内外对神经的营养和促生长作用基础上，也通过实验表明神经损伤后的再生依赖于局部由雪旺氏细胞等提供的营养因子，神经导管内加入NGF和碱性成纤维细胞生长因子(Basicfibroblast growth factor，bFGF)后对神经的修复作用明显优于对照组。然而，NGF虽可注入到神经导管内，但其操作、作用时间效能难以控制，以致应用受限。虽然起支架作用的神经导管目前可被制备，雪旺氏细胞也可体外培养，但其分泌神经营养物质具有时效局限性，而且将其植入神经导管内的存活及克服其抗原性一时难以解决，细胞型组织工程离临床应用距离尚远。
技术实现思路
为了解决现有技术中各种促神经生长因子在支架中难以发挥其应有作用，以及注入的相关因子多处于液体状态，在导管内局部不宜存留，以及导管因自身结构特点容易塌陷，影响其功能、作用发挥的问题，本专利技术提供了一种新型缓释组织工程支架复合体及其制备方法，用于修复周围神经的缺损。本专利技术的缓释组织工程支架复合体所采用的技术方案是本专利技术所指的缓释组织工程支架复合体包括壳聚糖导管(A)、琼脂糖凝胶(B)、神经生长因子NGF(C)。其具体制备方法是(1)取15万单位的壳聚糖(浙江玉环海洋生物化工有限公司)5～10克加入150～200毫升2％乙酸溶液中，搅拌完全溶解后，加入1～5毫升甘油(增加膜片柔韧性)充分搅拌，次日将混合液倒入3面有隔挡(高约3.0毫米)的已经过处理的平板玻璃上，干燥后制成厚约0.1～0.5毫米的壳聚糖膜片，用直径1.6毫米的玻璃棒卷成直径约1.0～2.0毫米，厚0.1～0.5毫米的壳聚糖导管(A)，干燥保存。(2)取0.1～1.0克琼脂糖(浙江洞头县水产公司海生物化工厂)加入50～150毫升蒸馏水中，加热3分钟溶解后置于38℃水浴箱中。(B)(3)取琼脂糖凝胶(B)3～10ml加入NGF(C)(厦门北大之路生物有限公司)1支(2000AU)，充分溶解后，室温放置2分钟形成均匀包裹NGF的琼脂糖凝胶以备用。经上述制备方法所制作出的缓释组织工程支架复合体直接把NGF包裹于琼脂糖凝胶中，注入壳聚糖导管，使NGF随着琼脂糖凝胶的降解不断的释放，形成新型的具有缓释功能的复合型组织工程神经支架，具有良好的生物相容性、生物降解性，较好的强度支撑及NGF的缓释功能。本专利技术的有益效果是在神经桥接术中对神经导管壁起到有效的支撑作用，能防止管壁塌陷，同时为周围神经的修复与再生过程中发挥促进组织引导作用，并营造了有利于神经缺损修复与再生的微环境。在作为加入导管中的促神经修复与再生物质(NGF)的载体时还能发挥生物控释或细胞外基质载体的作用。本专利技术采用的材料在人体内可吸收降解，无毒无害，无须二次手术，应用操作简单，可以大大提高导管修复神经缺损的疗效。目前，在大鼠体内已经进行了实验，并取得了显著效果。选取雄性SD大鼠30只，体重250～克300克之间。由辽宁医学院实验动物中心提供。将大鼠随机分为3组，每组10只，分别设为对照组I(单纯壳聚糖导管组)，对照组II(自体神经组)和实验组(复合支架组)。10％水合氯醛400mg/kg腹腔注射，麻醉后股后部正中切口，暴露左后肢中段坐骨神经，实验组和对照组I离断6mm，9/0显微外科缝合线分别与神经远近断端外膜处缝合一针，打结，尾线交叉自导管对侧端穿出将神经套入导管内各1mm，管外再把2尾线打结固定，管内形成10mm神经缺损，其中实验组在神经套入管内之前，把包裹NGF的琼脂糖凝胶注入导管内神经断端之间。对照组II离段神经10mm，离段的神经倒置后再吻合于神经缺损处。使用庆大霉素喷洒于手术切口处，预防感染。术后20℃～22℃，相对湿度40％～70％，室内通风良好，以标准颗粒饲料喂养，并观察其术后恢复情况。1动物一般观察术后1周内各组大鼠精神萎靡、厌动，术侧腿部行动困难，各组动物手术切口愈合较好，未见有感染发生；术后2周各组大鼠术侧足底均发生明显红肿，对照组I有6只、实验组有3只、对照组II有4只大鼠出现足底踝关节后部皮肤溃疡；术后1个月时各组大鼠精神已经恢复正常，术侧腿部已能活动，但是小腿不能伸直，各足趾亦不能伸，呈自然弯曲状态，足底部红肿和溃疡均存在且有加重趋势，同时术侧腿部肌肉均有不同程度的萎缩。术后2个月时，各组大鼠的小腿仍不能伸直，各足趾不能伸，呈自然弯曲状态，而且对照组I有4只、实验组2只、对照组II有3只术侧足趾与健侧相比出现了不同程度的萎缩。术后3个月时，出现萎缩的大鼠的情况无明显改善，对照组I出现有3只萎缩进一步加重，各组大鼠的足底的红肿和溃疡已经有所恢复。术后4个月时，实验组、对照组II大鼠的腿部红肿和溃疡已基本消失，除对照组I有3只、实验组和对照组II各1只萎缩外，其余大鼠小腿部肌肉基本恢复正常。2术后4个月解剖学观察术后4个月见实验组和对照组I再生神经全部长入远端导管，与周围组织有轻度粘连，导管表面覆盖有薄层结缔组织，管壁无塌陷，炎性反应不明显，管壁仍可支撑，但变软变薄，部分吸收。剖开导管见再生神经实验组要粗于对照组I。3术后4个月标本HE染色光镜观察术后4个月再生的坐骨神经纵切HE染色组织切片显示三组再生神经全部长入远端，对照组II神经排列最整齐，优于实验组和对照组I，在神经密集程度、血管化程度上，实验组和对照组II要好于对照组I。术后4个月再生的坐骨神经横切HE染色组织切片于轴突图象分析仪上检测实验组再生神经的直径与数目要优于对照组I，与对照组II相当，但后者排列更规则些。坐骨神经横切面HE染色组织切片于轴突图象分析仪上检测结果，见表2表2坐骨神经横切面有髓神经纤维数目和有髓纤维直径(像素值) 有髓神经纤维数目和有髓纤维直径实验组与对照组I相比料**P＜0.01，与对照组II相比P＞0.05。4.术后4个月透射电镜超微本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于周围神经缺损修复与重建的缓释组织工程神经支架复合体，其材料包括有壳聚糖导管（Ａ）、琼脂糖凝胶（Ｂ）和神经生长因子ＮＧＦ（Ｃ）。

【技术特征摘要】
1.一种用于周围神经缺损修复与重建的缓释组织工程神经支架复合体，其材料包括有壳聚糖导管(A)、琼脂糖凝胶(B)和神经生长因子NGF(C)。2.根据权利要求1所说的缓释组织工程神经支架复合体，其制备方法为(1)取15万单位的壳聚糖(浙江玉环海洋生物化工有限公司)5～10克加入150～200毫升2％乙酸溶液中，搅拌完全溶解后，加入1～5毫升甘油，充分搅拌，次日将混合液倒入3面有隔挡的已经过处理的平板玻璃上，干燥后制成厚约0.1～0.5毫米的壳聚糖膜片，用直径1.6毫米的玻璃棒卷成直径约1.0～2.0毫米，厚0.1～0.5毫米的壳聚糖导管(A)，干燥保存。(2)取0.1～...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伟，范明，徐艳，刘淑红，孙亮，吕刚，智晓东，
申请(专利权)人：辽宁医学院附属第一医院，王伟，
类型：发明
国别省市：21[中国|辽宁]