本发明专利技术公开了一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用，由正向和反向引物组成，其正向引物的核苷酸序列见SEQIDNo.1：5′-TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3′；反向引物的核苷酸序列见SEQIDNo.2：5′-YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3′；其中，Y=C/T，W=A/T，V=G/A/C，N=A/G/C/T，R=A/G，B=G/T/C，H=A/T/C。本发明专利技术引物通用性好，检测方法快速准确，为进出口安全提供了保证。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用。
技术介绍
豇豆花叶病毒亚科(Cbffloririaae)属于类小RNA病毒目QPicornavirales)、\牲豇豆病毒科中的一个亚科，包含豇豆花叶病毒属(Cbfflorirm)、蚕豆病毒属 (.Fabavirus)和线虫传多面体病毒属U^povirus)等3个病毒属，共有53种病毒。豇豆花叶病毒亚科病毒是一类对农业生产安全造成重要威胁的病毒，多种病毒具有十分广泛的寄主范围，并可造成多种作物严重损失。根据2007年公布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，该病毒亚科中被列为检疫性病毒的种类有南芥菜花叶病毒UraZ^s mosaic virus, ArMV)、蚕豆染色病毒(^roat/ bean stain virus, BBSV)、菜豆荚斑驳病毒、Bean pod mottle virus, BPMV)、豆工豆重花口十病毒(CbfFpea severe mosaic virus, CPSMV)、桃丛簇花叶病毒{Peach rosette mosaic virus, PRMV)、烟草环斑病毒、Tobacco ringspot 口>狀，TRSV)、番茄黑环病毒(Jomato black ring virus, TBRV)、番茄环斑病毒 {Tomato ringspot virus, iToRSV),共 8 种。2004 年 Maliogka 等建立了豇豆花叶病毒科 iComoviridae)(即现在的豇豆花叶病毒亚科)病毒通用检测的巢式RT-PCR，但还未见常规的通用RT-PCR检测方法。本申请专利技术人重新寻找豇豆花叶病毒亚科的RNAl基因组上的保守区域，根据保守区域序列重新设计一对简并引物，通过反转录(reverse transcription, RT)和聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction, PCR)建立了豇豆花叶病毒亚科的通用RT-PCR检测方法，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果，并根据序列测定结果进行病毒种类鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用。本专利技术引物通用性好，检测方法快速准确，为进出口安全提供了保证。为了达成上述目的，本专利技术的解决方案是一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物，由正向和反向引物组成，其正向引物的核苷酸序列见SEQ IDNo. 1:5' -TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3‘；反向引物的核苷酸序列见 SEQ ID No. 2 5' -YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3‘；其中，Y=C/T，ff=A/T, V=G/ A/C, N=A/G/C/T, R=A/G, B=G/T/C, H=A/T/C。一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测的检测方法，包括如下步骤以样品总RNA为模板，利用上述的引物进行RT-PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增DNA片段的位置判定结果，病症叶片中均能检出407 451 bp的DNA片段。所述的RT-PCR反应包括反转录和PCR扩增两个过程。所述的RT-PCR的反应过程中反转录反应的温度为42°C，PCR扩增的先用退火温度 42°C进行5个循环，然后用退火温度50°C进行30个循环，延伸温度为72°C。本专利技术的有益效果为本专利技术根据豇豆花叶病毒亚科病毒RNAl基因组序列设计引物，该引物可用于豇豆花叶病毒亚科病毒的通用RT-PCR检测。本专利技术检测方法能够快速准确地判断样品是否有豇豆花叶病毒亚科病毒，引物通用性好，检测方法快速准确，为进出口安全提供了保证。附图说明图1是豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR方法对各种亚科病毒的特异性试验结果，包括9种线虫传多面体病毒属QN印ovirus)病毒、7种豇豆花叶病毒属、Comovirus、病毒、和1种蚕豆萎蔫病毒属0 如)病毒。S卩，1为南芥菜花叶病毒(ArMV)分离物1病叶、2为烟草环斑病毒(TRSV)病叶、3为番茄环斑病毒(ToRSV)分离物1病叶、4为樱桃卷叶病毒(CLRV)病叶、5为烟草黑环病毒(TBRV)病叶、6为桃丛簇花叶病毒(PRMV)病叶、7为葡萄扇叶病毒(GFLV)病叶、8为乌饭树叶斑驳病毒(BLMoV)病叶、9为悬钩子环斑病毒(RpRSV) 病叶、10为菜豆荚斑驳病毒(BPMV)病叶、11为豇豆花叶病毒(CPMV)分离物1病叶、12为豇豆重花叶病毒(CPSMV)分离物1病叶、13为蚕豆染色病毒(BBSV)病叶、14为南瓜花叶病毒 (SqMV)病叶、15为红三叶草斑驳病毒(RCMV)病叶、16为蚕豆萎蔫病毒1号(BBWVl)病叶、 17为萝卜花叶病毒(RaMV)病叶、18为番茄环斑病毒(ToRSV)分离物2病叶、19为番茄环斑病毒(ToRSV)分离物3病叶、20为豇豆花叶病毒(CPMV)分离物2病叶、21为豇豆重花叶病毒(CPSMV)分离物2病叶、22为南芥菜花叶病毒(ArMV)分离物2病叶、23为南芥菜花叶病毒(ArMV)分离物3病叶，M为100 bp的DNA Mark。图2是应用豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR方法检测健康寄主植物的结果。 1-10分别为蒲瓜、普通烟、番茄、黄瓜、南瓜、鹊豆、蚕豆、豇豆、西瓜、百合的健康叶片。图3是应用豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR方法检测百合病叶的结果。1为健康百合叶片的检测结果，2 - 6为发病百合叶片的检测结果，7为空白对照，M为100 bp的 DNA Mark。具体实施例方式下面实施例用于对本专利技术的进一步说明，但不用来限制本专利技术的范围。实施例11.引物设计与合成根据豇豆花叶病毒亚科中苏铁坏死矮化病毒(CNSV)、葡萄铬黄花叶病毒(GCMV)、 GFLV、黑醋栗退化病毒(BRV)、RaMV, SqMV, BPMV, RCMV, CPMV, CPSMV, BBWVl、蚕豆萎蔫病毒 2 号(BBWV2)、ArMV、TRSV、GFLV、RpRSV、TBRV、甜菜环斑病毒(BRSV)、PRMVjoRSV 病毒的 RNAl 基因组序列设计引物，引物序列为SEQ ID No. 1 (上游)5' -TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3‘； SEQ ID No. 2 (下游)5' -YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3‘。为便于测序，在引物中分别引入通用测序引物BCABESTTM Sequencing Primer RV-M和M13-47 (下划线)，引物序列为:SEQ ID No. 1 (Comov-sf-F2) 5 ‘ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3‘SEQ ID No. 2 (Comov-sf-R2) 5 ‘ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3‘ 2.总RNA的提取1)取0.1 g植物发病叶片，加入1 ml的TRIzol (美国hvitrogen公司)试剂，移入灭菌的1. 5 ml离心管中，室温下保持本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用ＲＴ－ＰＣＲ检测用简并引物，其特征在于由正向和反向引物组成，其正向引物的核苷酸序列见ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１：５′－ＴＧＴＧＡＹＴＡＹＷＶＮＶＶＮＴＴＹＧＡＴＧＧ－３′；反向引物的核苷酸序列见ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２：５′－ＹＴＴＲＴＣＨＢＴＶＣＣＡＴＣＶＧＴＡＡＴ－３′；其中，Ｙ＝Ｃ／Ｔ，Ｗ＝Ａ／Ｔ，Ｖ＝Ｇ／Ａ／Ｃ，Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ，Ｒ＝Ａ／Ｇ，Ｂ＝Ｇ／Ｔ／Ｃ，Ｈ＝Ａ／Ｔ／Ｃ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：廖富荣，黄蓬英，林石明，
申请(专利权)人：厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：92
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